一、酶切連接
一般來說，限制性內(nèi)切酶的選擇非常重要。建議從以下方面判斷選擇：
1.限制性內(nèi)切酶的識別序列在目的載體中存在且只有一個，在目的片段中不存在；
2.盡量選擇酶切產(chǎn)物為粘性末端、酶切效率高的限制性內(nèi)切酶，如BamH I、Hind III 等；
3.雙酶切時，注意緩沖液對兩種內(nèi)切酶的活性影響，可根據(jù)具體活性相應調(diào)整酶量和反應時間；若緩沖液不能同時滿足兩種酶的要求，需要分步酶切；
4.單酶切時，建議對線性化載體進行去磷酸化操作，減少載體自身環(huán)化的出現(xiàn)。
注： 酶 切 后， 為 防 止 載 體 自 連 ， 尤 其 當 酶 切 后 產(chǎn) 物 末 端 可 互 補 或 是 平 端 時 （ 產(chǎn) 物 末 端 的 磷 酸 基團 和 羥 基 基 團 可 連 接 成 為 酯 鍵 導 致 自 連 發(fā) 生 ）， 有必要進行載體的去磷酸化 。在載體去磷酸化過程中，堿性磷酸酶可去除載體末端的5’磷酸基團 。

引物設(shè)計與PCR擴增

1.完成目的片段 PCR 擴增引物設(shè)計后，根據(jù)載體線性化使用的限制性內(nèi)切酶，分別在上下游引物的 5’端引入對應內(nèi)切酶的酶切位點與保護堿基；

2.建議使用高保真酶進行目的片段的 PCR 擴增，并摸索退火溫度，優(yōu)化反應體系和程序。

PCR / 酶切產(chǎn)物的純化回收

PCR/ 酶切反應后，產(chǎn)物應當進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，判斷是否存在目的大小的條帶；
2.推薦使用切膠回收的方式純化回收 ( 切膠時間最好控制在 3min 內(nèi)，避免紫外照射對 DNA 的損傷 )，回收濃度使用 NanoDrop/OneDrop 等儀器檢測，并跑膠鑒定是否僅存在目的條帶；
3.回收濃度低時，可通過增加 PCR/ 酶切反應體系，采取多管反應單管回收的方式，提高回收產(chǎn)物的濃度；
4.PCR 產(chǎn)物應當在完成切膠回收操作后，再進行酶切反應及后續(xù)的純化回收。

目的片段與載體的連接

利用 T4 DNA 連接酶完成酶切后載體與片段的連接重組。
1. 連接體系中使用的線性化載體與目的片段摩爾比可在 1:1 ~ 1:10 之間調(diào)整，一般最適比例為 1:3；
2. 平末端載體與 DNA 片段連接時，應首先將載體進行去磷酸化操作，減少載體自身環(huán)化的出現(xiàn)；
3. 連接體系各組分投入體積≥ 1μl，濃度過高時可稀釋后使用。

感受態(tài)轉(zhuǎn)化涂板
1.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞建議使用克隆用化學感受態(tài)細胞，不建議使用表達用感受態(tài)細胞；
注：DH5α、Fast-T1 適合≤ 15kb 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化；XL10 適合 >10kb 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
2.重組產(chǎn)物體積與感受態(tài)細胞體積的比例為 1:10，推薦 10μl 重組產(chǎn)物加入至 100μl 感受態(tài)細胞或 5μl 重組產(chǎn)物加入至 50μl 感受態(tài)細胞；
3.熱激時間：按照感受態(tài)細胞說明書操作進行；
4.平板抗生素抗性：平板使用抗性與轉(zhuǎn)化的載體抗性需保持一致；
5.菌液涂板體積：將菌液離心（2500×g、3min），移液槍吸取丟棄多余 LB 培養(yǎng)基，保留
100μl 重懸后全部涂板；或吸取合適體積涂板。

單克隆菌落PCR鑒定

1.挑取平板中體積大小適中的單克隆菌落，避免選擇過大或過小的單克隆菌落；

2.挑取數(shù)個單克隆菌落進行鑒定分析；
3. 挑取的菌落放入已添加 10μl ddH2O 的 1.5ml 或 2ml EP 管中溶解混勻后，吸取 1-2μl 作為
PCR 反應（10/20μl 體系）模板；
4. 推薦使用一對分別位于片段和載體的上下游引物進行 PCR 鑒定。

常見問題分析

未酶切或部分酶切

1. 限制性內(nèi)切酶失活：建議使用新酶；

2. 反應體系與程序非最佳化：按照說明書建議操作；

3. 限制性內(nèi)切酶濃度過低：建議增加酶使用量；

4. DNA 模板過多：按照說明書建議操作；

5. 體系存在抑制劑：對照組操作驗證；

6. 識別位點錯誤：測序驗證序列信息；

7. DNA 可能形成超螺旋結(jié)構(gòu)：增加酶量；

8. 識別位點過于接近 DNA 末端：末端添加保護堿基。

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