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消滅 PCR 非特異性擴(kuò)增的方法

發(fā)布時(shí)間： 2023-06-28　　點(diǎn)擊次數(shù)： 2408次

非特異性擴(kuò)增，即進(jìn)行 PCR 所擴(kuò)增出來(lái)的條帶不是所要的，引物與模板在非目的條帶處有錯(cuò)配，導(dǎo)致延伸產(chǎn)物不是目的條帶。例如引物二聚體，即引物在退火過(guò)程中產(chǎn)生了 hairpin 結(jié)構(gòu)或其他二級(jí)結(jié)構(gòu)，或者引物在模板的某些位置非特異性地結(jié)合，也同樣會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物都是通過(guò)引物延伸產(chǎn)生的。當(dāng)引物產(chǎn)生了二聚體或者非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物之后，引物本身就無(wú)法再延伸形成 PCR 產(chǎn)物了，這樣的情況下，非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物越是多，那目的產(chǎn)物就越是少。如果在 qPCR 過(guò)程中，就會(huì)在熔解曲線中形成雙峰。

消滅 PCR 非特異性擴(kuò)增的方法：
１、引物設(shè)計(jì)的過(guò)程中要用 Primer premier 5.0 來(lái)驗(yàn)證一下二聚體；

2、引物合成后，先做一次梯度 PCR，檢測(cè)最合適的退火溫度，一般高退火溫度可以提高引物對(duì)模板的特異性從而降低引物二聚體；

3、降低 Mg2+濃度，鎂離子濃度高，會(huì)導(dǎo)致大量的非特異性擴(kuò)增，但是沒(méi)有鎂離子的話(huà)，也會(huì)導(dǎo)致 Taq 酶的失活；

4、降低 dNTP 濃度，dNTP 也是非特異性擴(kuò)增的一個(gè)罪魁禍?zhǔn)?，降低它的濃度，也能有效降低二聚體及其他非特異性擴(kuò)增；

5、降低引物濃度，一般的 PCR 引物都是過(guò)量的，降低了引物濃度自然也能降低引物之間形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性；

6、提高退火溫度，這個(gè)道理很簡(jiǎn)單，引物的退火溫度提高，引物間的二級(jí)結(jié)構(gòu)形成可能性就會(huì)降低；

7、延長(zhǎng)退火時(shí)間，這個(gè)也可以減弱引物間結(jié)合的可能性；

8、DMSO 及甜菜堿，這些 PCR 促進(jìn)劑，主要是用于 CG 含量高的模板上，降低 DNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，但根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，加入 DMSO 之后需要同時(shí)提高一點(diǎn)退火溫度來(lái)補(bǔ)平（qPCR 不太適用）；

9、熱啟動(dòng)法，通過(guò) 95℃的高溫?zé)釂?dòng)，高溫解鏈，使得引物間的二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，以此降低二聚體產(chǎn)生。

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