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DNA 復(fù)制需要哪些元素

發(fā)布時(shí)間： 2023-06-28　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1993次

1) 需要脫氧核苷三磷酸：
進(jìn)行 DNA 合成必須具備的 2 個(gè)關(guān)鍵底物之一，即 4 種脫氧核苷三磷酸——dGTP、dCTP、dATP、dTTP。通常商品化 PCR 酶會(huì)提供這 4 種脫氧核苷三磷酸的混合物 dNTP。
2) 需要引物-模板接頭：
DNA 合成的第二個(gè)重要底物是一具有特定序列的雙鏈 DNA，稱為引物-模板接頭，即指導(dǎo)互補(bǔ)脫氧核苷酸添加的單鏈 DNA 模板和與模板互補(bǔ)但比模板短的一小段序列。
較長(zhǎng)的 DNA 鏈有一個(gè)與引物退火的區(qū)域和一個(gè)毗鄰的單鏈 DNA 區(qū)，此區(qū)作為 DNA 合成的模板；較短的引物與較長(zhǎng)的 DNA 鏈退火，且必須有與模板單鏈 DNA 區(qū)毗鄰的游離的 3’-OH，當(dāng)新核苷酸加入時(shí)引物的 3’-OH 端得以延伸。一般而言，引物-模板接頭的引物部分才是 DNA 合成的底物，而模板僅僅提供選擇哪種核苷酸進(jìn)行添加的必要信息。
因此我們?cè)谠O(shè)置 PCR 反應(yīng)程序時(shí)第一步是高溫變性（一般會(huì)設(shè)置成 95℃變性），就是為了把雙鏈的模板變性成單鏈，第二步是降低溫度，是為了讓引物能互補(bǔ)匹配到單鏈模板上。

3) 需要 DNA 聚合酶：
DNA 聚合酶的三維結(jié)構(gòu)類似于一只右手。手掌域是催化活性位點(diǎn)，可以催化任意 4 種脫氧核苷三磷酸的添加，這一區(qū)域結(jié)合 2 個(gè)二價(jià)金屬離子（通常是 Mg2+或 Zn2+）。其中一個(gè) 金屬離子降低 3’-OH 對(duì)其氫的親和力，這會(huì)產(chǎn)生一個(gè)準(zhǔn)備對(duì)引入 dNTP 上的 α-磷酸進(jìn)行親核攻擊的 3’O-。第二個(gè)金屬離子與 dNTP 的 β-和 γ-磷酸負(fù)電荷協(xié)同作用，穩(wěn)定由引物和引入核苷酸連接在一起時(shí)所產(chǎn)生的焦磷酸。所以我們?cè)?PCR 時(shí)，反應(yīng)體系里加入適量的 Mg2+是十分重要的，添加的量少導(dǎo)致 PCR 酶無(wú)法發(fā)揮最大活性，添加太多則降低酶反應(yīng)的特異性。

DNA 聚合酶是一種延伸酶，其催化是快速的。DNA 合成的速度主要取決于 DNA 聚合酶的延伸能力。在實(shí)際應(yīng)用中，一般的Taq酶的延伸速度大致是擴(kuò)增產(chǎn)物在2kb以內(nèi)是1kb/min。擴(kuò)增產(chǎn)物超過(guò)2kb 的部分可以以500bp/min 來(lái)計(jì)算。比如擴(kuò)增2kb，延伸時(shí)間就設(shè)置成2min，而擴(kuò)增 3kb，就可以把延伸時(shí)間設(shè)置成 4min。也有延伸能力更強(qiáng)的酶，那么延伸時(shí)間就按產(chǎn) 品說(shuō)明書描述的來(lái)設(shè)置。

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