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多潛能干細胞的誘導

發(fā)布時間： 2022-12-02　　點擊次數(shù)： 1779次

簡介

多潛能干細胞（in-duced pluripotent stem cells，iPS）技術不僅可以解決胚胎干細胞來源引起的倫理問題，而且自體 iPS 細胞可以避免異體來源胚胎干細胞移植引起的免疫排斥反應。目前就成體細胞誘導產(chǎn)生 iPS 細胞相關的幾種轉錄因子以及誘導方法、如何提高誘導產(chǎn)生 iPS 細胞的效率以及 iPS 細胞臨床應用方面都是在 Yamanaka 報道的誘導方案基礎上的改良。

原理

Yamanaka 法誘導多能干細胞的原理是把 Oct3/4，Sox2、c-Myc 和 Klf4 這四種轉錄因子基因克隆入病毒載體，然后引入小鼠成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)可誘導其發(fā)生轉化，產(chǎn)生的 iPS 細胞在形態(tài)、基因和蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與胚胎干細胞相似。

材料與儀器

器材：

① 37 ℃ 水浴鍋

② 一次性無菌培養(yǎng)皿

③ 一次性無菌移液管

④ T75 培養(yǎng)瓶

⑤ 涂有明膠的 6 孔板

⑥ 15 ml 離心管、注射器和針頭

試劑：

① 材料：提前制備好的飼養(yǎng)層細胞

② DMEM 培養(yǎng)基

③ 胎牛血清

④ 谷酰胺

⑤ 非必需氨基酸

⑥ DF12 培養(yǎng)基

⑦ 血清替代物
⑧ 谷酰胺＋2-巰基乙酉享溶液
⑨ b-FGF 溶液
⑩ β-巰基乙醇

步驟

多潛能干細胞的誘導的基本過程可分為如下幾步：

（一）試劑配制

（1）MEF 培養(yǎng)基的配制 DMEM 培養(yǎng)基，450 ml；胎牛血清（56 ℃ 熱滅活 30 min），50 ml；200 mmol/L-谷酰胺，5 ml；非必需氨基酸，5 ml。將所有組分混合后，用 0.22 μm 濾器過濾除菌，4 ℃ 保存，保持無菌。

（2）胚胎干細胞培養(yǎng)基的配制 DF12 培養(yǎng)基，200 ml；血清替代物，50 ml；200 mmol/L-谷酰胺＋2-巰基乙酉享溶液，1.25 ml；非必需氨基酸 100x 溶液，2.5 ml；b-FGF 溶液，5 ml。所有組分都加入 250 ml 培養(yǎng)瓶中，用 0.22 μm 濾器過濾除菌。培養(yǎng)基最好在 2 周內(nèi)使用。

（3）200 mmol/L-谷酰胺＋2-巰基乙酉享溶液的配制。200 mmol/L-谷酰胺（使用前冷凍保存），5 ml；β-巰基乙醇，7 μl?；靹?。

（4）b-FGF 的配制。b-FGF，10 μg；0.1％ BSA 無菌，5 ml。溶解后按 0.5 ml 每份分裝，冷凍保存。

（二）開始前準備

（1）小鼠胚胎成纖維細胞的獲得通過同源重的方法將雙選擇標記系統(tǒng)，如βgeo（neo 用于 G418 篩選，βGal 用于顯影）基因盒，同源重組到小鼠 Nanog 基因位點，使βgeo 受內(nèi)源性 Nanog/O）ct 啟動子控制，由于 Nanog 只在 ESC 中表達，所以來源于 Fbx 158geo / 3gco 小鼠的體細胞由于缺乏 ES 特性，不能在 G418 中生長。按 MEF 制備方法，從 Fbx15βgeo/βgco 小鼠中分離培養(yǎng) Fbx15βgea/βgeo 來源的 MEF。

（2）經(jīng)典的「Yamanaka」法 OCT4，SOX2，KLF4，C-MYC 病毒的準備。

（3）MEF 飼養(yǎng)層細胞的制備。

（三）細胞誘導

（1）感染前一天，將處于對數(shù)生長期的 Fbx15 Pgco/βgeo 來源的 MEF 細胞鋪于 6 孔培養(yǎng)板，使感染時細胞達到 80％的匯合。

（2）按測定的病毒滴度，以 10 個 pfμ/細胞加入適量濃縮病毒上清，用 MEF 培養(yǎng)基補齊至每個孔 2.5 ml 體積，再加入終濃度為 8 μg/ml 的 polybrene（聚凝胺），混合均勻。

（3）棄去 Fbx15 βgeo/βgco 來源的 MEF 細胞的培養(yǎng)上清液，加入上步制備的病毒溶液，6 孔培養(yǎng)板每孔加 2.5 ml 的病毒溶液。37 ℃ 孵育 4 h 到過夜。

（4）換新鮮胚胎干細胞培養(yǎng)基。

（5）感染后 3 d，向培養(yǎng)基中添加終濃度為 0.3 mg/ml 的 G418。

（6）每 2～3 天換新鮮胚胎干細胞培養(yǎng)基，添加終濃度為 0.3 mg/ml 的 G418，進行克隆篩選，持續(xù) 2～3 周。

（7）在培養(yǎng)過程中，觀察克隆形成情況。將其中與 ES 細胞形狀相似克隆按 ESC 培養(yǎng)方法擴增傳代，并進行鑒定。

（四）實驗結果及分析

誘導成功的 iPS 需進行多能性的鑒定，鑒定的內(nèi)容包括以下幾方面。

（1）形態(tài)學標準。

（2）生長特性。

（3）發(fā)育潛能：2N 囊胚注射，獲得嵌合體病能通過生殖系遺傳給后代（形成三胚層細胞并能夠形成配子細胞遺傳給下一代）；4N 囊胚注射，通過此方法獲得的小鼠，胚外組織來源于 4N 的細胞，而小鼠則全部來自 iPS 細胞。

（4）標志分子表達。

（5）表觀遺傳學特性。

注意事項

（1）目前已經(jīng)報道的轉錄因子的組合有很多，在 Yamanaka 四因子基礎上，還報道的組合有 OCT4，SOX2，NANOG 和 LIN28；OCT4，SOX2 和 KLF4；Sox2，c-Myc 和 Klf4；使用前冷凍保存。按 50 ml 分裝后冷凍保存，使用前融化。
（2）目前用于過表達上述核心轉錄因子的手段有很多，包括反轉錄病毒載體，腺病毒載體，轉染質粒，重組蛋白誘導方法，化學小分子［例如 G9a 組蛋白甲基轉移酶的小分子抑制劑 BIX-01294（BIX）］等。
（3）對于提高誘導效率方面，MSC 作為誘導細胞其誘導成為 iPS 的效率較皮膚來源成纖維細胞的比率高：組蛋白脫乙?；敢种苿﹥?nèi)戊酸（VPA）和新報道的維生素- C 能顯著提高 iPS 的誘導比率。
（4）陽性克隆的篩選方法包括報告基因篩選和形態(tài)學標準篩選。報告基因篩選方法是指用基因重組技術建立具有藥物抗性基因的小鼠成纖維細胞抗性受內(nèi)源性 nanog 或（）ct4 表達調控，通過壓力篩選，表達耐藥基因的克隆優(yōu)勢生長。

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