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qPCR實驗為什么要制作熔解曲線？
發(fā)布時間： 2021-10-11 點擊次數(shù)： 5439次熒光DNA結合染料法的缺點是它們能在反應中結合所有DNA雙鏈，包括在實時熒光PCR中產(chǎn)生的引物二聚體，和其他非特異性產(chǎn)物，引起大量的背景噪聲信號。
這種噪聲會影響我們對靶基因產(chǎn)量的評估，甚至熒光強度和靶基因的起始量、全長根本沒什么關系。
因此，我們使用熒光DNA染料結合法時，需要對擴增產(chǎn)物進行熔解曲線的分析。通過對擴增反應產(chǎn)物逐漸升溫，同時監(jiān)測每一步的熒光信號來制作熔解曲線。
熔解曲線的縱坐標是熒光信號值，橫坐標是溫度值。通過觀察產(chǎn)生的信號峰和對應溫度，可以判斷產(chǎn)物狀態(tài)。
理想情況下，熔解曲線應該是單峰，峰值對應溫度是特異性產(chǎn)物的退火溫度，這才能說明擴增產(chǎn)物中特異性產(chǎn)物占比大。熒光DNA結合染料法的缺點是它們能在反應中結合所有DNA雙鏈，包括在實時熒光PCR中產(chǎn)生的引物二聚體，和其他非特異性產(chǎn)物，引起大量的背景噪聲信號。
這種噪聲會影響我們對靶基因產(chǎn)量的評估，甚至熒光強度和靶基因的起始量、全長根本沒什么關系。
因此，我們使用熒光DNA染料結合法時，需要對擴增產(chǎn)物進行熔解曲線的分析。通過對擴增反應產(chǎn)物逐漸升溫，同時監(jiān)測每一步的熒光信號來制作熔解曲線。
熔解曲線的縱坐標是熒光信號值，橫坐標是溫度值。通過觀察產(chǎn)生的信號峰和對應溫度，可以判斷產(chǎn)物狀態(tài)。
理想情況下，熔解曲線應該是單峰，峰值對應溫度是特異性產(chǎn)物的退火溫度，這才能說明擴增產(chǎn)物中特異性產(chǎn)物占比大。
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