siRNA轉(zhuǎn)原代肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑

一、產(chǎn)品說(shuō)明：

1、產(chǎn)品名稱

Advanced DNA RNA Transfection Reagent

2、品牌

ZETA LIFE

2、包裝規(guī)格

貨號(hào)：AD600075

規(guī)格：0.75ml

3、儲(chǔ)存條件

常溫運(yùn)輸，4℃保存，可保存兩年，拒絕反復(fù)凍融。

二、使用說(shuō)明：

1、材料準(zhǔn)備

RNA 濃度 20 uM /L

質(zhì)粒 DNA 濃度 300 ng-2 ug/ul（注意：①溶解于無(wú)菌雙蒸水或超純水；②無(wú)內(nèi)毒素 ）

2、操作步驟

提前 1 天接種細(xì)胞：細(xì)胞匯合度在 60-80%左右，再進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

核酸復(fù)合物制備：將核酸與轉(zhuǎn)染試劑按照 1:1 關(guān)系直接混合，用移液器吹吸 10-15 次混勻，室溫靜 止 10-15 分鐘。

在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入核酸復(fù)合物：根據(jù)參考用量在細(xì)胞中加入核酸復(fù)合物，并輕輕混勻；細(xì)胞培養(yǎng)基 里面可以含有血清。

細(xì)胞換液：轉(zhuǎn)染 24 小時(shí)后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行正常換液，懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)程中不用換液。

分析結(jié)果：質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染 48-72 小時(shí)后熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，48-96 小時(shí)檢測(cè) mRNA 或蛋白表達(dá)。若 進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選，則在轉(zhuǎn)染后 24-48 小時(shí)左右加入適量的藥物進(jìn)行篩選。siRNA 轉(zhuǎn)染后 9 小時(shí)熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，48-72 小時(shí)檢測(cè) mRNA 或蛋白表達(dá)。

三、注意事項(xiàng)：

1、質(zhì)粒 DNA 必須溶解于無(wú)菌雙蒸水或超純水，但不能溶解于提取試劑盒提供的 Buffer。溶解于 Buffer 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率會(huì)下降 80%左右，甚至?xí)D(zhuǎn)染失敗。

2、質(zhì)粒必須去除內(nèi)毒素，內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞將產(chǎn)生很大的細(xì)胞毒性，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率下降 70%-80%左 右，甚至導(dǎo)致轉(zhuǎn)染失?。ㄍ扑]使用 Qiagen、TIANGEN、Omega 去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒）。

3、復(fù)合物的制備過(guò)程中是絕對(duì)不能用其他任何試劑對(duì)核酸或轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行稀釋，只需將核酸和轉(zhuǎn)染 試劑兩者按 1:1 比例直接混合，如果進(jìn)行了稀釋會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染失。

4、轉(zhuǎn)染試劑與核酸混勻后用移液器吹打 10-15 次，室溫孵育 10-15 分鐘后即可加入細(xì)胞培養(yǎng)板。

5、轉(zhuǎn)染 24 小時(shí)后進(jìn)行正常換液，不能像 Lipo2000 一樣轉(zhuǎn)染 4-6 小時(shí)后換液。

6、原代細(xì)胞、免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基里面不能含有雙抗培養(yǎng)基。

四、各品牌轉(zhuǎn)染試劑類型與Zeta Life轉(zhuǎn)染試劑的差異比較：

1、Thermo品牌Lipo 2000采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體，需要更換培養(yǎng)基；特點(diǎn)是毒性大；轉(zhuǎn)染前后需要更換培養(yǎng)基；可以轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA、siRNA（效果差）。

2、Thermo品牌Lipo 3000采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體，需要更換培養(yǎng)基；特點(diǎn)是相比Lipo 2000毒性略小；轉(zhuǎn)染前后需要更換培養(yǎng)基；可以轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA、siRNA（效果較差）。

3、Thermo品牌RNAiMAX采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體，需要更換培養(yǎng)基；特點(diǎn)是專門(mén)用來(lái)轉(zhuǎn)RNA，對(duì)于細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率一般，對(duì)干細(xì)胞和神經(jīng)原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果差。

4、Promega品牌FuGENE 6采用脂質(zhì)混合體、特定緩沖液，需要更換培養(yǎng)基；特點(diǎn)是本質(zhì)還是脂質(zhì)體；只能轉(zhuǎn)DNA；含有微量動(dòng)物源成分，適用細(xì)胞種類因此受限；轉(zhuǎn)染前后需要更換培養(yǎng)基；親塑性，轉(zhuǎn)染效率會(huì)因使用PE管（塑料管）而大打折扣。

5、Roche品牌FuGENE HD采用脂質(zhì)混合體、特定緩沖液，需要更換培養(yǎng)基；特點(diǎn)是本質(zhì)還是脂質(zhì)體；只能轉(zhuǎn)DNA；親塑性，轉(zhuǎn)染效率會(huì)因使用PE管（塑料管）而大打折扣。

6、Zeta Life品牌Advanced系列采用新型工業(yè)材料，不需要更換培養(yǎng)基；特點(diǎn)是不需要換液，無(wú)細(xì)胞毒性，轉(zhuǎn)染效率高，適用細(xì)胞種類多，可轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA、siRNA及小動(dòng)物活體轉(zhuǎn)染。

siRNA轉(zhuǎn)原代肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑各規(guī)格：

品牌：美國(guó)Zeta Life        貨號(hào)：AD600025        0.25ml

品牌：美國(guó)Zeta Life        貨號(hào)：AD600050        0.5ml

品牌：美國(guó)Zeta Life        貨號(hào)：AD600075        0.75ml

品牌：美國(guó)Zeta Life        貨號(hào)：AD600150        1.5ml

品牌：美國(guó)Zeta Life        貨號(hào)：AD600500        5ml

品牌：美國(guó)Zeta Life        貨號(hào)：AD601000        10ml