細胞死亡

動物細胞的死亡主要有三種方式：細胞凋亡、細胞壞死和細胞自噬。目前對動物細胞凋亡的特征、機制和生物學(xué)功能的研究較為深入。

細胞凋亡也被稱為程序性細胞死亡  (programmed cell Death,  PCD)  。PCD 最初是發(fā)育生物學(xué)中提出的概念,  其含義是發(fā)育過程中發(fā)生的某 類細胞的大量死亡,而這種細胞死亡要求特定的基因表達。細胞凋亡的典型特征是DNA規(guī)律性斷裂為 180-200bp整數(shù)倍的片段,并暴露出3'-OH 末端,  在瓊脂糖凝膠電泳時呈現(xiàn)有規(guī)律的梯狀條帶。

細胞壞死是區(qū)別于細胞凋亡的另一種典型死亡方式。當(dāng)細胞受到意外損傷。如物理、化學(xué)因素或嚴重的病理性刺激的情況下細胞壞死才會發(fā)生。 此時細胞內(nèi) ATP 濃度下降,  細胞質(zhì)出現(xiàn)空泡,  細胞質(zhì)膜受損,  細胞內(nèi)含物,  包括膨大和破碎的細胞器以及染色質(zhì)片段釋放到胞外,   引起 周圍組織的炎癥反應(yīng)。 與細胞凋亡不同,  細胞壞死過程中染色質(zhì)不發(fā)生凝集 ,  也不產(chǎn)生有規(guī)律的 180-200 bp 的 DNA 降解片段,  而是被隨機降 解,  瓊脂糖凝膠電泳時呈現(xiàn)彌散性分布,  俗稱 u 拖尾 n 現(xiàn)象。

細胞凋亡

凋亡過程模式圖

1. 正常細胞 2.細胞凋亡的起始 3.凋亡中的細胞 4.凋亡小體被鄰近吞噬細胞吞噬

細胞凋亡檢測方式

細胞凋亡檢測有很多途徑和方式,  Annex in v 法早期凋亡檢測,  線粒體膜通透性變化檢測,  凋亡蛋白酶活力檢測,  TUNEL檢測,   DNA ladder 電泳檢測等等。目前應(yīng)用范圍最大的是能夠?qū)υ缙诘蛲鲞M行檢測的Annexin V法，和能夠區(qū)分壞死和凋亡細胞并特異性標記出細胞凋亡的TUNEL法。

A Annex in V檢測

檢測原理：

在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。這一改變被認為是特異性的，并且可作為凋亡細胞表面改變的標記。Annexin V是一類廣泛分布于真核細胞胞漿內(nèi)的鈣離子依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，分子量為35~36KDa，能與細胞凋亡過程中外翻到膜外的PS高親和力特異性結(jié)合，被作為檢測細胞凋亡早期的靈敏指標之一。

以經(jīng)典方法 Annex in V-FIT C/PI 為例。 用標記了 FITC 的 Annex in V 作為熒光探針,  再結(jié)合核酸染料碘化丙啶 (prop idi um  lodi de, PI ),  利 用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生,  并對凋亡細胞進行分群。  原理如下 :

FITC 標記的 Annex in V保留了與 PS 的高親和力,  Annex in  V-FIT C 染色可在凋亡早期就檢測到外翻的 PS,  識別出凋亡的發(fā)生。PI 是一種 核酸染料,  pl 不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜,  但可穿透膜損傷的細胞,  如晚期凋亡細胞或者壞死細胞的細胞膜并與其內(nèi)的DNA結(jié)合，將細胞核染色，可用來區(qū)分早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞或壞死細胞。

方法優(yōu)勢:
Annex in V 法檢測細胞凋亡主要有三大優(yōu)勢:

1）特異性標記早期凋亡細胞膜表面的PS，聯(lián)用核染料，對凋亡細胞進行分群和定量

2）精確反應(yīng)細胞群體的凋亡趨勢

3）操作自由度高，發(fā)射波長不一致的情況下可兼容共染

數(shù)據(jù)展示

下圖使用Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit(Vazyme #A211)進行凋亡檢測。使用不同濃度的喜樹堿（Camptothecin,CPT）誘導(dǎo)健康Jurket細胞（人T淋巴瘤細胞）凋亡，并同時做競爭封閉實驗，證明Annexin V-FITC的染色特異性。

結(jié)果表明，Annexin V法可以對凋亡細胞進行分群（左下角細胞為未凋亡細胞，右上角為晚期凋亡細胞）并且可以對不同程度的凋亡進行區(qū)分

                                                      Annexin V-FITC/PI 染色檢測不同程度凋亡

用喜樹堿CPT誘導(dǎo)Jurkat細胞凋亡，誘導(dǎo)濃度分別為0、4、8、12、16uM，分別誘導(dǎo)4h后，參照產(chǎn)品說明書實驗方案進行染色，用流式細胞儀檢測結(jié)果如圖，（A）0 uM.（B）4 uM.（C）8 uM.(D)12  uM.(E)16 uM.(F)競爭封閉實驗，采用16uM CPT誘導(dǎo)Jurkat細胞4h后，參照說明書收集并洗滌細胞，于染色前加入無燃料標記的Annexin V蛋白孵育10min,再進行Annexin V-FITC/PI染色。無染料標記的Annexin V結(jié)合了細胞上的PS，再進行染色時，Annexin V-FITC無法結(jié)合PS，這說明了染色的特異性。

B TUNEL法

檢測原理：

TUNEL 測定法是一種末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記法。這一方法借助一種可觀測的標記物，如熒光素，能對凋亡細胞的核DNA中產(chǎn)生的3’-OH末端進行原位標記。使用熒光顯微鏡即可進行觀察。TUNEL法中，直接標記步驟少，操作簡便，間接標記有信號放大的作用，檢測靈敏度高，是目前檢測細胞凋亡最為常用、最為普遍的檢測方法之一。

TUNEL 根據(jù)標記物的不同，可以分為熒光法和顯色法兩種，熒光法需要使用熒光顯微鏡進行觀察，主要顯示的是細胞核的狀態(tài)，顯色法使用普通光學(xué)顯微鏡即可進行觀察，更方便對組織細胞本身的情況進行觀察。

方法優(yōu)勢：

1）特異性標記凋亡細胞，而不標記壞死細胞；

2）相對于Annexin V從細胞群體角度反映凋亡，TUNEL法更有利于觀察組織、細胞的整體凋亡狀態(tài)；

3）TUNEL法使用樣本更廣：石蠟切片、冰凍切片、貼壁細胞、懸浮細胞；

4）方法兼容度高，可以根據(jù)自身需求進行免疫組化、免疫熒光共染等操作；

數(shù)據(jù)展示

Hela細胞爬片（共染GAPDH）

使用DNase I 室溫處理10min后進行TUNEL染色

使用產(chǎn)品：TUNEL BrightRed Apoptosis Detection Kit(Vazyme #A113)

A:DAPI B:TUNEL染色，標記凋亡細胞 C：GAPDH D：Merge

                                                           小鼠肝臟石蠟切片

使用產(chǎn)品：TUNEL Colorimetric Apoptosis Assay Kit(Vazyme #A114)進行染色

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