02 ATAC-seq 基本操作流程

本產(chǎn)品適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色質(zhì)可及性／開(kāi)放性研究，針對(duì)的細(xì)胞投入量為100-100,000個(gè)。

必須具備的材料

1、ATAC-Seq建庫(kù)試劑盒

Hyperactive ATAC-Seq Library Prep Kit for Illumina (Vazyme #TD711)

2、建庫(kù)接頭

單端96種接頭（每個(gè)貨號(hào)對(duì)應(yīng)24種接頭）：

TruePrep Index Kit V4 for Illumina (Vazyme #TD204/TD205/TD206/TD207)

雙端96種接頭：

TruePrep Index Kit V2 for Illumina (Vazyme #TD202)

雙端384接頭：

TruePrep Index Kit V3 for lllumina (Vazyme #TD203)

3、其他

Qubit 試劑（Vazyme #EQ121）、PCR儀、磁力架、低吸附EP管、PCR管、無(wú)水乙醇

注意事項(xiàng)：

6、擴(kuò)增產(chǎn)物片段分選

推薦使用ATAC DNA Clean Beads對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行兩步法片段分選，分選方案為0.55x／1.2x。

（1）渦旋振蕩混勻ATAC DNA Clean Beads并吸取33 μl（0.55x）至60μl PCR產(chǎn)物中，渦旋振蕩或使用移液器吹打10次充分混勻，室溫孵育5min。

（2）將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架上，使磁珠與液體分離，待溶液澄清后（約5min）小心轉(zhuǎn)移88μl上清（上清體積＝總體積93-5μl）至新的滅菌PCR管中，丟棄磁珠。

（3）渦旋振蕩混勻ATAC DNA Clean Beads 并吸取72μl（1.2x）至上清中，渦旋振蕩或使用移液器吹打10次充分混勻，室溫孵育5min。

（4）將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架上，使磁珠與液體分離，待溶液澄清后（約5min）小心移除上清。

（5）保持反應(yīng)管始終置于磁力架上，加入200μl新鮮配制的80％乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30sec，小心移除上清。

（6）重復(fù)步驟5，總計(jì)漂洗兩次。

（7）保持反應(yīng)管始終置于磁力架上，開(kāi)蓋空氣干燥約5min。

（8）將反應(yīng)管從磁力架上取出，加入22 μl Nuclease-free ddH2O洗脫。渦旋振蕩或使用移液器吹打10次充分混勻，室溫孵育5min。

（9）將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架上，使磁珠與液體分離，待溶液澄清后（約5min）小心吸取20μl上清至新的滅菌PCR管中，-30～-15℃條件下保存。

7、文庫(kù)質(zhì)控

1、用Qubit儀器和對(duì)應(yīng)的試劑測(cè)文庫(kù)濃度

2、安捷倫2100檢測(cè)文庫(kù)片段分布

測(cè)序技術(shù)參數(shù)推薦

1、測(cè)序策略：lllumina平臺(tái)，MGI平臺(tái)，PE 150

2、推薦數(shù)據(jù)量：開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域的差異鑒定，不低于30M reads／樣本

ATAC-seq 技術(shù)關(guān)鍵

樣本準(zhǔn)備

細(xì)胞活性

建議細(xì)胞活性＞90％，可以使用臺(tái)盼藍(lán)染色，進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的操作應(yīng)盡量輕柔，以保持細(xì)胞的活性。生長(zhǎng)狀態(tài)不佳或死亡的細(xì)胞中，蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合的狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變，甚至蛋白脫落，變成裸露的DNA，轉(zhuǎn)座子隨機(jī)切割可能產(chǎn)生較強(qiáng)的背景噪音，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

細(xì)胞投入量與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)

受樣本類型的影響，實(shí)驗(yàn)中可兼容的細(xì)胞投入量并不是固定的，早期實(shí)驗(yàn)建議投入50,000-100,000個(gè)細(xì)胞。

文庫(kù)產(chǎn)出只要滿足上機(jī)需求即可，無(wú)需未來(lái)獲得更高的文庫(kù)產(chǎn)量而設(shè)置過(guò)高的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，循環(huán)數(shù)過(guò)多會(huì)導(dǎo)致過(guò)度擴(kuò)增、偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴(kuò)增突變積累等多種不良后果。

特殊樣本流程

特殊樣本流程摘要

特殊樣本的核提取以及操作流程可參考以下文獻(xiàn)

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