步驟

PEG 介導(dǎo)的雞血細(xì)胞融合的基本過(guò)程可分為如下幾步：

（一）試劑配制

（1）Alsever 溶液

葡萄糖 2.05 g，檸檬酸鈉 0.80 g，NaCl 0.42 g，溶于雙蒸水中，定容至 100 ml。

（2）GKN 溶液

NaCl 8 g, KCl 0.40 g, Na2HPO4 · 12H2O 3.77 g, NaH2PO4 · 2H2O 0.78 g，葡萄糖 2 g，酚紅（phenol red）0.01 g，溶于雙蒸水中，定容至 1000 ml。

（3）詹納斯綠染液

稱(chēng)取 30 mg 詹納斯綠染料，溶于 100 ml 生理鹽水中，混勻，即可得到 0.03％ 的染液。

（4）50％ PEG 溶液

稱(chēng)取 10 g PEG，151bf／in2（103.4 kPa）高壓滅菌 20 min，待冷卻至 50～60 ℃ 時(shí)加入 10 ml 溫?zé)岬?GKN 溶液并混勻。如配制過(guò)程中 PEG 發(fā)生凝固，重新加熱使其熔化。用 NaHCO3 調(diào) pH 至 8.0。4 ℃ 保存?zhèn)溆茫R用前置 37 ℃ 預(yù)溫。最好現(xiàn)用現(xiàn)配。

（二）細(xì)胞融合

（1）將新鮮的雞血直接注入加有一支肝素鈉的燒杯中，混勻抗凝。

（2）用量筒量取一定量的上述抗凝雞血，加入 Alsever 溶液，配制成 1：4 細(xì)胞懸液備用或 4 ℃ 冰箱保存（3～4 d 內(nèi)可用）。

（3）用 1 只 5 ml 刻度離心管取 0.5～1 ml 上述雞血懸液，加入 0.85％ 生理鹽水至 5 ml，混勻平衡后，800 g 離心 5 min，棄上清液。再按上述條件重復(fù)離心 2 次。最后，棄上清液，加 GKN 溶液至 5 ml，800 g 離心 5 min。

（4）棄上清液，加適量 GKN 溶液，吸管吹打混勻，制成 10％ 細(xì)胞懸液。

（5）取以上懸液以血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，若細(xì)胞密度過(guò)大，用 GKN 溶液稀釋至（3～4）x107 個(gè)/ml（此步也可省略）。

（6）取以上細(xì)胞懸液 1 ml 于離心管，或在原離心管中棄去一部分懸液，保留 1 ml 于原離心管中。將離心管放入 37 ℃（39 ℃ 更佳）水浴鍋中預(yù)熱。

（7）待溫度恒定后，向上述 1 ml 細(xì)胞懸液中緩慢逐滴加入 0.5 ml 預(yù)熱的 50％ PEG 溶液（慢慢沿離心管壁流下融合劑），且邊加邊輕播離心管混勻，最后用吸管輕輕吹打混勻。放入水浴鍋中靜置孵育。

（8）細(xì)胞融合一段時(shí)間（10～20 min）后，加入 GKN 溶液至 5 ml，靜置于水浴鍋中繼續(xù)孵育 20 min 左右。

（9）取出離心管，800 g 離心 5 min，使細(xì)胞完-全沉降。棄上清液，加 GKN 溶液至 5 ml，重懸沉淀，重復(fù)離心 1 次。

（10）棄上清液，加入少量（0.5 ml 左右）GKN 溶液，混勻，取少量懸液于載玻片加入詹納斯綠染液，用牙簽攪勻，染色 5 min（也可用吉姆薩染液染色 5～10 min）。蓋上蓋玻片，觀察細(xì)胞融合情況并計(jì)算融合率。雞血

注意事項(xiàng)