步驟

材料

無(wú)菌

培養(yǎng)瓶（如果需要離心時(shí)）

生長(zhǎng)培養(yǎng)基

吸量管，1ml，10ml

注射器和19號(hào)針頭（如果你使用玻璃凍存管）

非滅菌

保護(hù)性手套和面罩

37℃無(wú)菌水，10cm深，盛于清潔、用乙醇擦拭過(guò)的帶蓋的水桶中

鑷子

70%乙醇

棉簽

1%萘黑（酰胺黑）或0.4%臺(tái)盼藍(lán)

操作步驟

1.檢查凍存目錄，確定將要復(fù)蘇的凍存管的位置

2.收集所有材料，準(zhǔn)備培養(yǎng)基，標(biāo)記培養(yǎng)瓶

3.從凍存罐中取出凍存管，檢查標(biāo)簽，確定是否是所需要的凍存管，若小管未浸沒(méi)在液氮中，將小管放入塑料除菌水桶內(nèi)37℃的燒杯中。盡可能避免水沒(méi)過(guò)官帽，因?yàn)闀?huì)增加污染的機(jī)會(huì)。

安全提示

將凍存管從液氮中取出時(shí)，必須穿實(shí)驗(yàn)衣，戴手套。若凍存管浸沒(méi)在液氮中，則必須待面罩或護(hù)目鏡，也必須穿實(shí)驗(yàn)衣戴手套。儲(chǔ)存在液氮中的凍存管，包括塑料小管都可能吸入液氮，復(fù)蘇時(shí)將可能發(fā)生劇烈爆炸。該種情況下，必須使用帶蓋的塑料水桶進(jìn)行復(fù)蘇，以控制-爆-炸。

4.當(dāng)凍存管復(fù)蘇時(shí)，再次檢查標(biāo)簽以確定為所需的細(xì)胞；隨后用70%乙醇徹-底擦洗凍存管，然后在超凈工作臺(tái)內(nèi)打開(kāi)凍存管，

5.用1ml吸管將凍存管內(nèi)含物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。

6.將培養(yǎng)基緩慢的加至細(xì)胞懸液中:以每2min 10ml的速率進(jìn)行滴加。開(kāi)始時(shí)逐滴加入，然后可加快，逐漸稀釋細(xì)胞和細(xì)胞保護(hù)劑。

對(duì)于需要通過(guò)離心去除細(xì)胞保護(hù)劑的細(xì)胞：

（a）按照步驟6，在離心管或常規(guī)容器內(nèi)緩慢稀釋細(xì)胞。

（b）100g離心2min。

（c）棄去含有細(xì)胞保護(hù)劑的上清培養(yǎng)液。

（d）以新鮮培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。

（e）接種入培養(yǎng)瓶。

7.凍存管內(nèi)殘留物可用萘黑或臺(tái)盼藍(lán)染色，以測(cè)定細(xì)胞的存活率。

8.24h后檢查：

（a）對(duì)于貼壁單層細(xì)胞，依據(jù)預(yù)測(cè)密度（個(gè)細(xì)胞/cm2)的細(xì)胞照片，確認(rèn)細(xì)胞是否貼壁，估計(jì)細(xì)胞存活率。

（b）對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，檢查外觀（清晰的細(xì)胞質(zhì)，缺乏細(xì)胞顆粒），稀釋至常規(guī)的接種濃度。若進(jìn)行細(xì)胞技術(shù)，并估計(jì)細(xì)胞存活率后，接種濃度可能更精確，這種情況下， 可以將細(xì)胞稀釋至常規(guī)存活細(xì)胞接種濃度。

注意事項(xiàng)

1. 將凍存管從液氮中取出時(shí)，必須穿實(shí)驗(yàn)衣，戴手套。若凍存管浸沒(méi)在液氮中，則必須待面罩或護(hù)目鏡，也必須穿實(shí)驗(yàn)衣戴手套。儲(chǔ)存在液氮中的凍存管，包括塑料小管都可能吸入液氮，復(fù)蘇時(shí)將可能發(fā)生劇烈爆炸。該種情況下，必須使用帶蓋的塑料水桶進(jìn)行復(fù)蘇，以控制-爆-炸。

2. 塑料凍存管在使用前要仔細(xì)檢查，以防管壁破裂或螺口不配套造成密封 不嚴(yán)。

3. 用DMSO作為凍存保護(hù)劑時(shí)，用前應(yīng)先將凍存液在4℃預(yù)冷，解凍后應(yīng)馬 上洗去保護(hù)劑。

常見(jiàn)問(wèn)題

1. 檢查細(xì)胞活率。用1ml培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染料排除法檢查細(xì)胞存活率。

2. DMSO有-劇-毒，使用時(shí)要特別注意。此外，在凍存前越晚加入細(xì)胞越好，解凍后要盡快除去，以避免對(duì)細(xì)胞的毒害。