原理

傳統(tǒng)上的細(xì)胞凍存（甘油/二甲基亞砜做保護(hù)劑）講求的是：慢凍速溶。細(xì)胞凍存時(shí)向培養(yǎng)基中加入的甘油或二甲基亞砜（DMSO），這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。

用途

細(xì)胞保種

材料與儀器

【實(shí)驗(yàn)材料】細(xì)胞、DMSO、0.25% Trypsin-EDTA（或細(xì)胞刮刀）、100 X雙抗、PBS、胎牛血清、DMEM *培養(yǎng)基、75% 乙醇、胰酶、異丙醇；

【儀器與用品】?jī)龃婀堋?7度恒溫水浴鍋、培養(yǎng)皿（6 cm）、細(xì)胞凍存盒（已添加異丙醇）或凍存泡沫盒、記號(hào)筆、-80度冰箱、倒置相差顯微鏡、凍存管、37度恒溫水浴鍋、培養(yǎng)皿（6cm）、液氮罐、離心機(jī)、細(xì)胞房專(zhuān)用超凈臺(tái)、移液槍及移液槍頭（無(wú)菌或滅菌后烘干）、一次性細(xì)胞計(jì)數(shù)板、細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀、培養(yǎng)箱、移液管。

步驟

 1.  預(yù)先配制凍存液：按正常培養(yǎng)基：DMSO =9:1比列配制凍存液;

2.  取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái)，離心1000 rpm，5 min;

3.  去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5×106/mL～1×107/mL;

4.  將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml;

5.  在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱(chēng)，凍存時(shí)間、細(xì)胞代數(shù)及操作者;

6.     往凍存盒中加入異丙醇（在負(fù)八十冰箱中能以1℃/min的速度下降）放入負(fù)八十冰箱即可，建議12小時(shí)以上，一般可在負(fù)八十中保存半年至一年，長(zhǎng)期保存要轉(zhuǎn)移至液氮中；商用凍存液可以直接凍存管放負(fù)八十冰箱。

注意事項(xiàng)

1、液氮凍存不建議用國(guó)產(chǎn)凍存管，復(fù)蘇時(shí)容易爆管；

2、消化細(xì)胞時(shí)，不能過(guò)度消化；

3、DMSO溶于DMEM培養(yǎng)基會(huì)放熱，應(yīng)提前5-10分鐘配置凍存液。用凍存盒時(shí)避免異丙醇將標(biāo)記擦掉；

4、二甲基亞砜能穿透許多合成的或天然的膜，包括皮膚和橡膠手套。因此，應(yīng)謹(jǐn)慎處理。將凍存管放入液氮時(shí)，必須使用保護(hù)性手套和面罩。

常見(jiàn)問(wèn)題

1、細(xì)胞消化過(guò)度，導(dǎo)致復(fù)蘇時(shí)細(xì)胞狀態(tài)不好；

2、負(fù)八十冰箱中長(zhǎng)期保存細(xì)胞效果不好，應(yīng)及時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中；

3、國(guó)產(chǎn)凍存管在液氮中容易漏液氮，導(dǎo)致復(fù)蘇時(shí)曝管，所以放液氮中盡量使用質(zhì)量較好的凍存管。