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Real-time PCR實驗攻略（基本方法一）

發(fā)布時間： 2022-03-11　　點擊次數(shù)： 5568次

材料與儀器

步驟

實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）實驗流程

一、RNA的提取(詳見RNA提取及反轉錄)

不同組織樣本的RNA提取適用不同的提取方法，因為Real-Time PCR對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，所以，正式實驗前要選擇一款適合自己樣品的提取方法，在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。

在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂；取2ug進行RNA的甲醛變性膠電泳檢測，如果存在DNA污染時，要用DNase I進行消化（因為在處理過程中RNA極易降解，建議體系中加入適量RNA酶抑制劑）

二、DNase I 消化樣品RNA 中的DNA

三、RNA瓊脂糖凝膠電泳

1. 1%的瓊脂糖凝膠電泳凝膠的配制：

1）稱取瓊脂糖0.45 g放入三角瓶中，向其中加入4.5 ml的10×MOPS緩沖液和39.5 ml的DEPC水，放微波爐里溶化。

2）待冷卻到60攝氏度左右時，加入1 ml甲醛，搖勻（避免產(chǎn)生氣泡）。倒入凝膠板上凝固30 min。

2. 取各個RNA樣品4 μl，加入6×RNA電泳上樣緩沖液2 μl混勻，加入變性膠加樣孔中。

3. 120V電壓下電泳25 min。用凝膠紫外分析儀觀察，照相保存。

另外還有一種RNA檢測方法：
濃度檢測：取4 μl RNA，加蒸餾水至1 000 μl，混勻。測OD260、OD280

四、RNA反轉錄為cDNA

反轉錄程序(以MBI的M-MLV為例)

反轉錄引物的選擇與Real-Time PCR引物設計的要求

1）隨機六聚體引物：
當特定mRNA由于含有使反轉錄酶終止的序列而難以拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。

2）Oligo(dT)：
是一種僅對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉錄。由于Poly(A+)RNA只占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復雜性方面均要小。特別適合檢測多個基因的表達，這樣可以節(jié)約反轉錄的試劑，cDNA可以多次使用，可用于檢測稀有基因是否表達、從極少量細胞中定量檢測特定mRNA的表達水平。

3）特異性引物：
最特異的反轉錄方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA3'端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增。
做 Real Time PCR時，用于SYBR Green I/Eva Green 法時的一對引物與一般PCR的引物，在引物設計上所要求的參數(shù)是不同的。引物設計的要求：

① Tm=55-65 ℃

② GC=30-80%

③ PCR擴增產(chǎn)物長度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-300 bp之間都可。

④ 引物的退火溫度要高，一般要在 60 ℃以上。

要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。
至于設計軟件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都應該可以的。做染料法最關鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預防工作。對于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準備---尋找合適的引物非常不易。

五、cDNA與引物質(zhì)量檢測
取0.2 ml薄壁PCR管，編號。向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10 ul；加入正反向引物各0.5 ul（引物濃度10 uM），向管中加入混合的cDNA各1 ul。各管補加水至20 ul。
組份加量
2×PCRTaqMix 10 ul
10 uMPrimer FW 0.5 ul
10 uMPrimer RV 0.5 ul
Template DNA 1 ul
ddH2O 混勻至20 ul

混勻，置于TP600PCR儀中。95 ℃ 5 min；95 ℃15 s，60 ℃35 s ，40 cycles；72 ℃ 5 min；4 ℃ pause。
取擴增產(chǎn)物各8 μl，DL2000 分子量標準5 μl/泳道。1%瓊脂糖凝膠120V電壓下電泳25 min。用凝膠紫外分析儀觀察。

選擇特異性好，擴增效率高的引物作為實時熒光使用引物。

六、利用相對定量的方法分析目的基因表達量的情況
由于RNA純化后得率不同、RNA反轉錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，因此，在進行基因表達調(diào)控研究中都會用一些看家基因來標準化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表達調(diào)控分析時至少要做兩個基因，目的基因和一個看家基因。

七、定量 PCR檢測
取0.2 ml薄壁PCR管，分別編號。向各管中加入2×qPCR TaqMix12.5 ul，10 uM各基因正反向引物混合物0.5 ul，對應的cDNA各1 ul。一管中不加模板用作陰性對照。各管補加水至25 ul。

混勻，置于SLAN熒光定量PCR儀中。95℃5min預變性后，95℃15 s→65℃35 s（熒光檢測），40 cycles。熒光定量PCR一般把退火和擴增設成一個溫度，只在擴增出現(xiàn)問題時才會考慮設梯度。

（侯哥論文中的：95 °C 10分鐘→95 °C 15秒→60 °C 1分鐘；40個循環(huán)。）

以雙△Ct值法計算靶基因相對表達水平：

GRP78相對表達水平=2-△(△CT)

注：△CT =Ct(GRP78)-Ct(GAPDH); △(△CT)= △CT (LLLI)- △CT (contro1)。

如果在熒光背景信號階段出現(xiàn)很多拐點，可能的原因是體系未混勻或者存在固態(tài)雜質(zhì)；
如果向下探頭后又很快抬頭然后又向下探頭，可能原因是體系中模板量太高，建議模板稀釋后再用。
如果引物二聚體存在則陰性對照會出現(xiàn)抬頭現(xiàn)象，這在Real-Time PCR中很難避免；
若是陰性對照的溶解曲線出現(xiàn)和樣品中同樣的峰，說明體系配置中存在污染，則實驗結果不可用。

在溶解曲線中出現(xiàn)雙峰有三種可能：

① 引物峰，引物峰通常是兩峰中的前面一個，消除的辦法是降低體系中的引物量或重新設計引物；

② 在做基因表達差異時容易出現(xiàn)DNA被擴增峰（只在引物跨內(nèi)含子時存在），出現(xiàn)原因是提取RNA時存在DNA污染，可以通過電泳驗證，這時要重新消化RNA樣品中的DNA；

③ 擴增非特異，這時要重新摸擴增條件或重新設計并驗證引物。

八、表達差異的計算方法
絕對定量通過標準曲線計算起始模板的拷貝數(shù)；相對定量方法則是比較經(jīng)過處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標轉錄本或是目標轉錄本在不同時相的表達差異之間的表達差異。

2-△△CT方法是實時定量PCR實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法。

在有些情況下，并不需要對轉錄本進行絕對定量，只需要給出相對基因表達差異即可。顯然，我們說X基因在經(jīng)過某種處理后表達量增加2.5倍比說該基因的表達從1000 拷貝/細胞增加到2500拷貝/細胞更加直觀。

2-△△CT方法的推導（詳見實時定量PCR和2-△△CT法分析基因相對表達量）

補充：在DNase I 消化樣品RNA 中的DNA后，需要對樣品重新進行氯仿抽提，具體實驗流程如下：

消化后總體積100 ul，體積太少，不利于抽提，我們往往補加200 ulDEPC水。

1. 向離心管中加入等體積氯仿（約300 ul），劇烈顛倒，充分混勻至中層出現(xiàn)白色片狀沉淀。4℃14 000 rpm離心8 min，取上清（約250 ul）。

2. 加入1/10體積的NaAC（3 M）（約25 ul）和預冷的等體積異丙醇（約280 ul），-20℃放置20 min。

3. 4℃14 000 rpm離心15 min，去上清，注意不要觸到沉淀。

4. 加入1 ml的75%乙醇，4℃14 000 rpm離心3 min，去上清。

5. 瞬時離心，用200 ul（或10 ul）的槍頭小心吸去離心管底的殘存液態(tài)（勿吸到管底的沉淀）。

6. 把離心管放置于超凈臺晾至約5-10 分鐘（勿*干燥，否則很難溶）。加入30~50 μl的無RNase的水，靜止1 min 后，振蕩30sec，瞬時離心。

7. 將提取的RNA立即進行下游實驗，或放-20 ℃保存。

注意事項

北京協(xié)和醫(yī)學院阜外心血管病醫(yī)院心外科心血管病國家重點實驗室吳益和分享
實驗中必須堅持的一些好習慣
1. 加入試劑之前，把它混勻一下，以免放置時間長了濃度不均。
2. 移液槍用完之后要歸到最大計量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性。
3. 所有的試劑都自己配，出了問題才好找原因一. 防止RNA酶污染的措施。
一、防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均應在使用前于180 ℃的高溫下干烤6 h或更長時間。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
3. 有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10 min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。
4. 配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37 ℃處理12 h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌。
5. 操作人員戴一次性口罩. 帽子. 手套，實驗過程中手套要勤換。
6. 設置RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。

同實驗其他方法
實時熒光定量PCR技術
一、樣品RNA的抽提 1. 取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。 2. 兩相分離每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后
Real-time PCR實驗攻略（基本方法二）
二、DEPC處理方法如下1. DEPC處理（1）DEPC水：100 ml超純水加入0.2 ml DEPC，充分混勻，高壓滅菌。（2） Tip頭(槍頭）. EP管等在提RNA過程中及做RT時接觸RNA的

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