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輔助方案 TCA 沉淀測(cè)定標(biāo)記摻入量

發(fā)布時(shí)間： 2022-03-10　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1766次

原理
材料與儀器
被標(biāo)記的細(xì)胞懸液（見(jiàn)基本方案或備擇方案 1～4）
0.1％（m V）BSA／0.02%（m V）NaN3 10%TCA 溶液冷凍乙醇
連接真空管道的濾過(guò)裝置 2.5 cm 玻璃微纖維濾膜（Whatman GF／C）
步驟
1. 加 10～20 μl 被標(biāo)記的細(xì)胞懸液到 0.1 ml 0.1％（m/V）BSA/0.02％（m/V）NaN3 中，置于冰上。

2. 加 1 ml 冷凍的 10％（m/V）TCA 溶液。劇烈振蕩混勻，在冰上孵育 30 min。

3. 在真空濾過(guò)裝置內(nèi)，濾過(guò)細(xì)胞懸液到 2.5 cm 玻璃微纖維濾膜上。

4. 用 5ml 冷凍 10％TCA 溶液洗膜 2 次，再用乙醇洗 2 次。空氣干燥 30 min。

5. 在玻璃微纖維濾膜上點(diǎn)同樣體積（見(jiàn)步驟 1，10～20 μl）的放射性標(biāo)記的細(xì)胞懸液，在空氣中干燥。

6. 轉(zhuǎn)移濾膜到 20 ml 閃爍管里，加 5 ml 閃爍記數(shù)溶液，用閃爍記數(shù)儀測(cè)定放射活性。

7. 計(jì)算 TCA 沉淀標(biāo)記（見(jiàn)步驟 4）與總放射活性的比值（見(jiàn)步驟 5）。
注意事項(xiàng)
１. TCA 有強(qiáng)烈腐蝕性。在制備和操作 TCA 溶液時(shí)注意保護(hù)眼睛并避免皮膚接觸。
2. 洗液應(yīng)按照混合化學(xué)/放射性廢棄物處理。根據(jù)安全規(guī)程進(jìn)行處理。
常見(jiàn)問(wèn)題
同實(shí)驗(yàn)其他方法
氨基酸代謝標(biāo)記實(shí)驗(yàn)
1. 室溫融化 [35S] 標(biāo)記甲硫氨酸，并用預(yù)熱的（37℃）脈沖標(biāo)記培養(yǎng)基制備 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室溫下 300 g 離心 5 min，獲得懸液中 0.5 × 107~
備擇方案 1 對(duì)貼壁細(xì)胞
1. 在 100 mm 組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞到 80%~90% 融合（0.5 × 107~2 × 107 細(xì)胞，取決于細(xì)胞類型）。2. 如上所述制備 [35S] 甲硫氨酸的工作液體（見(jiàn)基本方案步驟 1
備擇方案 2 示蹤標(biāo)記細(xì)胞
1. 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)和每個(gè)樣品準(zhǔn)備 0.5 × 107 ~2 × 107 細(xì)胞，每 0 .5 × 107 ~2 × 107 細(xì)胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脈沖標(biāo)記
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