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乙醇沉淀法

發(fā)布時(shí)間： 2021-12-17　　點(diǎn)擊次數(shù)： 5662次

原理
DNA 溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí),乙醇會(huì)奪DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中,是加2倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合,其乙醇的最終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來(lái)替代懈水乙醇(因?yàn)闊o(wú)水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95%乙醇昂貴)。但是加95%的乙醇使總體積增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA損失也增大,尤其用多次乙醇沉淀時(shí),就會(huì)影響收得率。折中的做法初次沉淀DNA時(shí)可用95%乙醇代替無(wú)水乙醇,最后的沉淀步驟要使用無(wú)水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA.一般在室溫下放置15-30分鐘即可。
材料與儀器
DNA
乙酸鈉乙醇
EP管低溫離心機(jī) 移液器 -70度冰箱
步驟

1. 酶切前確定待切樣品的濃度, 并選擇合適的限制性內(nèi)切酶和配套Buffer。

2. 在離心管中加入如下成分：
10xBuffer　 1ul
待切樣品　　　xul
酶　　　　　　0.5-1ul
______________________
加水補(bǔ)足10ul

3. 混勻樣品并短暫離心使樣品沉于管底。

4. 將離心管置于37℃中溫育1-3hr，若待切樣品為PCR 產(chǎn)物，則可將反應(yīng)時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。

5. 用未酶切的質(zhì)粒作為對(duì)照，瓊脂糖電泳鑒定酶切結(jié)果。

注：當(dāng)酶切樣品用于回收而不是鑒定時(shí)，可按比例適當(dāng)加大反應(yīng)體積。雙酶切可選用二者活性都較高的Buffer 或者通用Buffer，但要注意不能有星反應(yīng)。

注意事項(xiàng)
移去上清液時(shí)需要緩慢操作，以免將DNA樣品弄出。
常見(jiàn)問(wèn)題
乙醇可以任意比和水相混溶,乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng),對(duì)DNA很安全,因此是理想的沉淀劑。
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