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CAT活性的相-抽提分析法

發(fā)布時間： 2021-12-16　　點擊次數(shù)： 1868次

材料與儀器
轉(zhuǎn)染細(xì)胞
氯霉素 Tris·Cl TMPD 二甲苯
離心機(jī) 離心管培養(yǎng)箱
步驟
一、來源于哺乳動物細(xì)胞

1. 按“CAT活性的層析分析法"中的步驟1~5的凍融法，制備哺乳動物細(xì)胞提取物。如果用胰蛋白酶消化或制細(xì)胞方法來收集細(xì)胞，則將原位裂解法的步驟1至4用以下的步驟2至4代替。

2. 室溫下，300 g 離心5 min，棄去上清。每107細(xì)胞加入1 ml 低滲緩沖液，離心，棄上清。然后每107細(xì)胞加Triton裂解液200 μl。

二、來源于植物原生質(zhì)體

1. 室溫下，2 000~4 000 g 離心5 min，將植物原生質(zhì)體細(xì)胞收集于1.5 ml 的微量離心管中，棄去上清。

2. 往細(xì)胞沉淀加50 μl 低滲緩沖液，在旋渦混合器上劇烈振蕩，將離心管置于-70℃ 15 min以上，或置于干冰/乙醇浴中5 min 以凍結(jié)樣品。融解樣品，在室溫下13 000 g 離心2 min，將上清移入一個干凈管中。

3. 對于分析50 μl 細(xì)胞提取液，配置如下CAT分析混合液
20 μl 0.01 μCi/μl ［3H］氯霉素
5 μl 5 mg/ml 丁酰輔(酶)A
5 μl 2 mol/l Tris·Cl，pH8.0
20 μl H2O

4. 對每組分析，將50 μl CAT分析混合液加入50 μl 細(xì)胞提取液中。37℃溫育30~90 min。

5. 用200 μl 2：1的TMPD/二甲苯劇烈報蕩提取乙?；穆让顾?，離心并移出上層液相至一只閃爍瓶中。

6. 樣品中加3~5 ml 閃爍液，計數(shù)測定CAT的活性。

同實驗其他方法
CAT活性的層析分析法
1. 100 mm 培養(yǎng)皿中的轉(zhuǎn)染了CAT表達(dá)質(zhì)粒的貼壁細(xì)胞，用PBS洗兩次，每次5 ml每培養(yǎng)皿加入1 ml TEN溶液。將細(xì)胞置于冰浴5 min。 2. 用橡膠
原位裂解細(xì)胞的CAT分析法
1. 60 mm 培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)染了CAT表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞，用2 ml PBS洗1次。每培養(yǎng)皿加入2 ml 低滲緩沖液，在室溫下溫育2~5 min。 2. 吸去低滲緩沖液，加入400 μl T
人生長激素的放射免疫分析法
1. 取轉(zhuǎn)染了hGH表達(dá)質(zhì)粒的哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)液100~500 μl。 2. 加100 μl 培養(yǎng)液或標(biāo)準(zhǔn)品至12 mm×75 mm 圓底試管中。加入100 μl 125I-
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