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哺乳動物細胞基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的實驗

發(fā)布時間： 2021-12-14　　點擊次數(shù)： 1466次

材料與儀器

哺乳動物細胞
*培養(yǎng)液
培養(yǎng)箱離心管

步驟

1. 確定所要轉(zhuǎn)染的細胞系能呈獨立集落生長。對于貼壁細胞，在10 cm 組織培養(yǎng)培養(yǎng)皿中接種約100個細胞，培養(yǎng)10~12天，毎4天換液1次。亞甲藍染色后對成活的細胞集落進行計數(shù)。

2. 確定母代細胞的選擇條件：將一培養(yǎng)皿上生長匯片的細胞按不小于1：15的比例分傳于含有不同藥物濃度的培養(yǎng)液中。培養(yǎng)10天。用合適的選擇培養(yǎng)液每4天換液1次，并檢查活細胞。

3. 確定轉(zhuǎn)染母代細胞的*的方法。可選用磷酸鈣或電穿孔方法。對于磷酸鈣轉(zhuǎn)染，在加DNA的前1天，將母代細胞按1：15分傳中*培養(yǎng)液中。

4. 用目的基因轉(zhuǎn)染母代細胞，含目的基因的質(zhì)粒與含標記基因的質(zhì)粒的摩爾比例不小于5：1。用擔體DNA替代含有目的基因的質(zhì)粒作為對照，分別進行幾次轉(zhuǎn)染。

5. 在無選擇條件下讓細胞倍增2次。將細胞按1：15分傳于選擇培養(yǎng)液中。

6. 在選擇培養(yǎng)液中接種5個以上培養(yǎng)皿，以得到盡可能多的能挑取和擴增成細胞系的細胞集落數(shù)，每4天用選擇培養(yǎng)液換液，培養(yǎng)10~12天，將培養(yǎng)皿對著光成一角度觀察其中的細胞克隆，其中的一只培養(yǎng)皿直可進行染色以便于計算細胞集落數(shù)。挑取大的、生長良好的細胞集落。

注意事項

如果用5：1的比例，沒有必要在轉(zhuǎn)染前將透擇標記基因與目的基因連接起來：如果選擇需要用大量的選擇性質(zhì)粒，有時無態(tài)保證5：1比例，故要將選擇標記基因及所要研究的目的基因構(gòu)建在同一個質(zhì)粒中。如果用含有所研究的基因進行轉(zhuǎn)染沒有形成克隆，而在含有的對照中卻可產(chǎn)生究隆，則所研究的基因能有細胞毒性。

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