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如何做核提取物制備優(yōu)化？
發(fā)布時間： 2021-11-24 點擊次數(shù)： 1672次材料與儀器
轉(zhuǎn)瓶或單層培養(yǎng)的哺乳動物細胞（如HeLa細胞）
高鹽緩沖液 分別含 0.8、1.0、1.2、1.4 及 1.6 mol L KCl
貝克曼 JS4. 2 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)子 50 mL 圓錐形刻度聚丙烯離心管（對較小體積的提取物也可用 15 mL 的離心管） Dounce 氏玻璃勻漿器（B 型研杵） Beckman JA-20 離心轉(zhuǎn)子或相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)子磁性攪拌器或傾斜臺 管型透析膜（14000 MWCO） 電導(dǎo)計步驟
1)按基本方案中步驟1?8操作。
2)在低鹽緩沖液中重懸細胞核后（1/2體積pnv，見基本方案步驟8)，將細胞核懸液分成5等份。
3)在冷室內(nèi)不斷攪拌，按如下方法在每份懸液中加入1/3體積高鹽緩沖液：在第1份 中加KCl濃度低至（0.8 mol/L)的高鹽緩沖液，其余各份中依次加入KCl濃度逐 漸增高（直到1. 6 mol/L)的高鹽緩沖液。
4)確定在離心管斜面上有提取出的細胞核，輕輕混合30 min。
5)25000 g離心30 min,除掉核。
6)將上清輕輕倒出，進行透析（見基本方案步驟12)，直到加KCl濃度最高的那份核懸液的電導(dǎo)率達到與透析液一致（100 mmol/L KCl)。提取物25000 g離心20 min。
7)檢測各份提取物的電導(dǎo)率并測定蛋白質(zhì)濃度（見基本方案步驟13和14)。
8)直接分析提取物或分裝到試管中，在液氮中速冷后放入-80℃保存。
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