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從成年骨骼肌分離和培養(yǎng)成肌細(xì)胞的方法步驟
發(fā)布時(shí)間： 2021-11-15 點(diǎn)擊次數(shù)： 2341次材料與儀器
D-PBSA
轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)液 生長(zhǎng)培養(yǎng)液 鏈酶菌蛋白酶液
尼龍網(wǎng) 手術(shù)刀 鋒利的長(zhǎng)剪刀 Petri培養(yǎng)皿 培養(yǎng)瓶 20ml離心管或一般容器 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板步驟
一、分離
1. 用手術(shù)刀切除活檢組織塊上的非肌性組織，然后用 D-PBSA 浸洗。
2. 稱重前，與肌纖維平行將切除活檢組織切成片，用沖洗。
3. 將組織片平行放入 Petri 培養(yǎng)皿蓋內(nèi)，切成較薄的柱狀組織塊，然后切成 1 mm3 小塊。不要擠壓組織。也可在試管內(nèi)用長(zhǎng)剪刀將組織剪成小塊，應(yīng)避免擠壓組織。
4. 用 D-PBSA 浸洗組織塊，靜置后吸去上清液。
5. 在 37°C 條件下，用鏈酶菌蛋白酶液（0.15 % 鏈酶菌蛋白酶（Sigma P-6911）、0.03% EDTA（Merck 8418）、20 IU/ml 青霉素和 20 μg/ml 鏈霉素（0.4% Eurobio PES3000），用 Ham F12 或 D-PBSA 配制，100ml）消化組織塊 1 h。每 1~3 mg 組織塊用 15 ml 鏈酶菌蛋白酶液。每間隔 10~15 min 輕輕搖晃試管。
6. 孵育后用吸管研磨組織塊。由于越來(lái)越多的細(xì)胞分離下來(lái)，培養(yǎng)液會(huì)逐漸變得渾濁。
7. 讓組織塊沉到試管的底部，形成沉降的組織塊（P1 ) 和上清液（S1）。
8. 用孔徑為 100 μm 的尼龍網(wǎng)將 S1 濾入 20 ml 離心管。輕輕搖晃或用吸管吹打上清液，使細(xì)胞混懸。
9. 離心（350 g，8~10 min）后，吸去上清液。
10. 準(zhǔn)確加入 10 ml 生長(zhǎng)培養(yǎng)液（Ham F12，添加 20 % FBS （Gibco 011-06290），200 ml），用帶有橡皮吸頭的吸管很輕微地混懸細(xì)胞。然后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。
11. 用生長(zhǎng)培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液，以約 1.5×104 個(gè)/ml 的細(xì)胞密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶。從 1 g 健康供體活檢組織約獲得 1~2×105個(gè)細(xì)胞。
12. 將 15 ml 消化液加入 P1，在 37°C 水浴中孵育組織塊 30 min，并定時(shí)搖晃。
13. 用吸管吹打細(xì)胞懸液，使細(xì)胞分散。然后，用尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液。用 20 ml 生長(zhǎng)培養(yǎng)液浸洗濾網(wǎng)。
14. 離心（350 g，8~10 min）后，計(jì)數(shù)細(xì)胞，按上述方法接種細(xì)胞。
15. 將培養(yǎng)瓶移入濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱，在 37°C 和 5 % CO2 的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
二、維持培養(yǎng)
16. 接種后 24 h 很輕微地?fù)Q培養(yǎng)液，以后每 3~4 d 換液 1 次。細(xì)胞主要向著分化生長(zhǎng)。人成肌細(xì)胞的生長(zhǎng)分 3 期，培養(yǎng)后 4~6 d 增殖達(dá)髙峰；8 d 左右排列成行；10~12 d 細(xì)胞融合和形成肌管增多。然而，必須記住一些細(xì)胞可能分化較早，絕大多數(shù)細(xì)胞分化時(shí)一些細(xì)胞仍處于增殖狀態(tài)。
三、傳代培養(yǎng)
17. 將少量 EDTA 輕輕注在細(xì)胞上面后立即吸去。
18. 加入 0.25 % 胰蛋白酶液，足以在細(xì)胞上面形成一薄層。
19. 當(dāng)細(xì)胞去附著時(shí)，加入 5~10 ml *生長(zhǎng)培養(yǎng)液，用吸管很輕微地吹打細(xì)胞，然后離心（350 g，10 min）。
20. 計(jì)數(shù)細(xì)胞，按一定密度種植細(xì)胞。
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