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報(bào)告基因：β-半乳糖苷酶的原位染色實(shí)驗(yàn)方法
發(fā)布時(shí)間： 2021-11-05 點(diǎn)擊次數(shù)： 2444次材料與儀器β-gal表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞
D-PBSA 染色液
6 孔培養(yǎng)板 恒溫箱 倒置顯微鏡實(shí)驗(yàn)步驟一、材料
非消毒物品
1. D-PBSA
2. 底物：X-gal（nvitrogen），以二甲基甲酰胺配成 20 mg/mL，用多聚丙烯管-20℃ 避光保存，最長可達(dá) 6 個(gè)月
3. 固定液：1.8% 的甲醛和 0.05% 戊二醛，均以 PBSA 液配制；將 85 mL 水、10 mL 的 10x D-PBSA、5 mL 福爾馬林（37% 甲醛溶液）及 0.2 mL 戊二醛（25% 溶液）混合，制備成固定液，于 4℃ 儲(chǔ)存
4. 染色液：含 5 mmol/L 鐵氰鉀，5 mmol/L 亞鐵氰鉀，2 mmol/LMgCl2，以 D-PBSA 配制，4℃ 儲(chǔ)存
5. 底物/染色液：1 mg/mLX-gal，以染色液配制，現(xiàn)用現(xiàn)配
6. 含 10% 甲醛的 D-PBSA 液
7. 將β-gal 的表達(dá)質(zhì)粒作為報(bào)告基因轉(zhuǎn)染（如：pcMV β-gal ）
二、操作步驟：
1. 用 2 mL D-PBSA 液洗滌細(xì)胞（如在 6 孔培養(yǎng)板上）。
2. 用 1 mL 固定液于室溫下固定細(xì)胞 5 min。
3. 用 2 mL D-PBSA 洗滌細(xì)胞 2 次。
4. 將 1 mL 底物/染色液加入到每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)，37℃ 孵育 2 h。
5. 用 2 mL D-PBSA 液沖洗每孔細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，計(jì)數(shù)藍(lán)染（β-gal 陽性）細(xì)胞。
6. 培養(yǎng)板的儲(chǔ)存。在每孔加 1 mL 含 10% 甲醛的緩沖鹽溶液，室溫下固定 10 min，然后用緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞，4℃ 儲(chǔ)存緩沖鹽溶液。
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