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免疫熒光（Immunofluorescence, IF）實(shí)驗(yàn)方法

發(fā)布時(shí)間： 2021-10-26　　點(diǎn)擊次數(shù)： 2657次

材料與儀器：
免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)（比如流式細(xì)胞儀）測(cè)定含量。

實(shí)驗(yàn)步驟：
免疫熒光實(shí)驗(yàn)的主要步驟包括細(xì)胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測(cè)等。細(xì)胞片制備（通俗的說法是細(xì)胞爬片）是免疫熒光實(shí)驗(yàn)的第一步，細(xì)胞片的質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)的成敗至關(guān)重要，原因很簡單，如果發(fā)生細(xì)胞掉片，一切都無從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片（Slides or Coverslips）的處理以及細(xì)胞的活力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出許多有益的細(xì)節(jié)或小竅門，非常值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒?，合適的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步驟是類似的，最重要的區(qū)別在于免疫熒光實(shí)驗(yàn)中要用到熒光抗體，因此必須謹(jǐn)記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。最后需要注意的是，標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

由于操作步驟比較多，同時(shí)在分析結(jié)果時(shí)無法像WB那樣可以根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識(shí)別，所以要得到一個(gè)好的免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果，除了需要高質(zhì)量的抗體，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反復(fù)優(yōu)化外，還必須設(shè)立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)對(duì)照?？傊庖邿晒鈱?shí)驗(yàn)從細(xì)胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到最后的封片及觀察拍照，每步都非常關(guān)鍵，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)流程中每個(gè)步驟的質(zhì)量，才能最終達(dá)到你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
（1）細(xì)胞準(zhǔn)備。對(duì)單層生長細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對(duì)懸浮生長細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。
（2）固定。根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。PBS洗滌3×5 min.
（3）通透。使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細(xì)胞，一般需要在加入抗體孵育前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.
（4）封閉。使用封閉液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉，時(shí)間一般為30min.
（5）一抗結(jié)合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.
（6）二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。
（7）封片及檢測(cè)。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。
（一）細(xì)胞準(zhǔn)備
用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞可以是直接生長在蓋玻片上的貼壁細(xì)胞，也可以是經(jīng)過離心后涂片的懸浮細(xì)胞或者是將取自體內(nèi)的組織細(xì)胞懸液離心后涂片。貼壁良好的細(xì)胞一般在培養(yǎng)時(shí)直接放入coverslips讓細(xì)胞生長在其上即可，盡量避免使用貼壁性能不好的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，以免后續(xù)的漂洗操作引起細(xì)胞脫落。少數(shù)實(shí)驗(yàn)需要使用這類細(xì)胞或者懸浮細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光觀察，建議使用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。

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