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免疫熒光技術(shù)-直接法

發(fā)布時(shí)間： 2021-10-26　　點(diǎn)擊次數(shù)： 2076次

材料與儀器：
抗體
PBS 伊文氏蘭
顯微鏡

實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 標(biāo)本經(jīng)固定后，PBS洗滌3×3 分鐘；
2. 加熒光素標(biāo)記的抗體，濕盒內(nèi)37 ℃孵育50 分鐘；
3. PBS洗滌3×3 分鐘；
4. 0.1 %伊文氏蘭復(fù)染；
5. PBS洗3 次，蒸餾水洗2 次，每次3 分鐘，以除去NaCl結(jié)晶；
6. 緩沖甘油封片，鏡檢。

要點(diǎn)：
直接法比較簡(jiǎn)單，特異性也較高，但每種熒光抗體只能檢測(cè)一種相應(yīng)的抗原，應(yīng)用范圍較窄，敏感性也較低。
對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察、判斷與分析是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要環(huán)節(jié)，判斷結(jié)果的好與壞、真與假需注意以下幾點(diǎn)。
1、必須設(shè)立對(duì)照染色（陰性或陽性對(duì)照），沒有對(duì)照染色的結(jié)果是沒有說服力的。
2、正確判斷真陰性和假陽性。
(1)了解抗原表達(dá)是否在特定部位，如VP陽性出現(xiàn)在神經(jīng)元胞漿，F(xiàn)os標(biāo)記細(xì)胞胞核，若陽性產(chǎn)物不在抗原所在部位，通常認(rèn)為是假陽性。
(2)對(duì)陰性結(jié)果，不能視為抗原不表達(dá)，應(yīng)該參考他人的結(jié)果或進(jìn)行相應(yīng)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，尋找原因，判斷是否為真陰性。
(3)在切片破損區(qū)域，出血壞死灶或刀痕等位置容易出現(xiàn)陽性表達(dá)，應(yīng)鑒別分析。
(4)染色時(shí)間的掌控很關(guān)鍵，可以避免非特異著色或假陽性細(xì)胞。
3.所有免疫組化操作步驟均能影響其結(jié)果，判斷的關(guān)鍵在于以下幾點(diǎn)。
(1)組織切片完整，結(jié)構(gòu)清晰，說明灌注取材、脫水、制片過程中沒有問題。
(2)切片著色鮮艷，說明抗體種屬之間配伍沒有錯(cuò)誤，染色步驟正常。
(3)陽性與陰性結(jié)果部位明確，說明所用抗體的特異性強(qiáng)。
4.切片例數(shù)、陽性產(chǎn)物數(shù)量統(tǒng)計(jì)、分析應(yīng)符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。

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