蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot|WB ）實(shí)驗(yàn)方法原理步驟及注意事項(xiàng)

一：蛋白提取

1、組織蛋白提取

1）所需器材：制冰機(jī)、標(biāo)記筆、兩套1.5ml EP管（最好高溫高壓處理）、一個(gè)大冰盒、一個(gè)1.5ml EP管盒、手套、眼科剪（最好高溫高壓處理）、新鮮組織或保存于-80℃冰箱組織、保存于4℃冰箱的PBS（最好高溫高壓處理）、移液槍、吸頭（最好高溫高壓處理）、兩套研磨棒（最好高溫高壓處理）、掌上離心機(jī)、濾紙、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一種蛋白酶抑制劑，劇毒）、離心機(jī)、燒杯、2×SDS凝膠上樣緩沖液、二硫蘇糖醇（DTT）、震蕩器、泡沫板。

2）操作步驟：

a.制冰機(jī)制冰；

b.標(biāo)記筆將兩套EP管做好標(biāo)記；

c.將大冰盒、EP管盒裝上冰，一套標(biāo)記筆做好標(biāo)記的EP管放置于大冰盒中，另一套標(biāo)記筆做好標(biāo)記的EP管放置于EP管盒中，戴好手套，帶上EP管盒、眼科剪剪取黃豆大?。s100mg）新鮮組織或保存于-80℃冰箱組織；

d.取出保存于4℃冰箱的PBS，往EP管中滴加1ml PBS，眼科剪剪碎組織（動(dòng)作快），掌上離心，棄上清，再往EP管中滴加1ml PBS，研磨棒研磨，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄上清，濾紙盡可能吸干管口殘留液體，估算EP管中沉淀物體積，以上步驟盡可能在冰上操作；

e.從4℃冰箱取出三去污裂解液，-20℃冰箱中取出PMSF置于大冰盒中，往EP管中滴加沉淀物3-5倍體積的三去污裂解液（一般為5倍）,再加入PMSF（二者比例為94：6）,研磨棒研磨（冰上充分裂解20-30分鐘），以上步驟均需在進(jìn)行；

f.離心機(jī)預(yù)冷，將充分裂解后的組織液4 ℃、10000轉(zhuǎn)離心10分鐘；

g.將燒杯用自來(lái)水洗凈，倒入單蒸水，電爐上煮沸；

h.備好2×SDS凝膠加樣緩沖液（存放于常溫），取出保存于-20℃冰箱的DTT,置于大冰盒中，將離心后的上清液用移液槍定量吸至另一套EP管中（勿吸取下層沉淀物），按上清液：2×SDS：DTT =1: 0.8:0.2加入2×SDS 及DTT，掌上離心，然后小心將EP管插入泡沫板，投入已煮沸的燒杯中煮6-8分鐘（電爐功率不要調(diào)太大，以免管蓋爆開）；

i. 將泡沫板用鑷子取出，置大冰盒中冷卻10分鐘，掌上離心，再放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

注意：裂解液也可酌情選用單去污裂解液或細(xì)胞裂解液等。

2、貼壁細(xì)胞蛋白提?。?xì)胞蛋白含量一般約為1x10-9mg/細(xì)胞）

1）所需器材：制冰機(jī)、細(xì)胞刮刀、標(biāo)記筆、兩套1.5ml EP管（最好高溫高壓處理）、兩個(gè)大冰盒、手套、長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶、保存于4℃冰箱的PBS、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一種蛋白酶抑制劑，劇毒）、移液槍、吸頭（最好高溫高壓處理）、濾紙、離心機(jī)、燒杯、4×SDS凝膠上樣緩沖液、二硫蘇糖醇（DTT）、泡沫板。

2）操作步驟

a.制冰機(jī)制冰；

b.細(xì)胞刮刀用去離子水洗凈、甩干，標(biāo)記筆將2套EP管做好標(biāo)記；

c.將兩個(gè)大冰盒裝上冰，標(biāo)記筆做好標(biāo)記的兩套EP管置于一個(gè)大冰盒上,帶上另一個(gè)大冰盒，取出長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶平放在大冰盒上；

d.戴好手套，取出保存于4℃冰箱的PBS、三去污裂解液、保存于-20℃冰箱的PMSF置于放有EP管的大冰盒上，往培養(yǎng)瓶中滴加2ml PBS漂洗一次，濾紙盡可能吸干瓶口殘留液體；

e.往培養(yǎng)瓶中滴加三去污裂解液（一般為47－141ul/50ml培養(yǎng)瓶）、再加入PMSF（二者比例為94：6），然后用細(xì)胞刮棒刮（不要漏刮四周瓶壁，刮不同處理組要更換刮子或重新洗凈，濾紙擦干），傾角靜置（使培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞裂解液集于一角），移液槍將培養(yǎng)瓶的裂解液吸至1.5ml EP管，冰上靜置15-25分鐘，以上步驟均需在冰上操作；

f.離心機(jī)預(yù)冷，將靜置15-25分鐘后的EP管4 ℃、10000轉(zhuǎn)離心10分鐘；

g.將燒杯用自來(lái)水洗凈，倒入單蒸水，電爐上煮沸；

h.備好4×SDS凝膠上樣緩沖液（存放在常溫），取出保存于-20℃冰箱的DTT置于冰上，用移液槍將離心后的上清液定量吸至另一套EP管中（勿吸取下層沉淀物），按上清液：4×SDS：DTT=3：0.8:0.2滴加4×SDS及DTT，掌上離心，然后小心將EP管插入泡沫板，投入已煮沸的燒杯中煮6-8分鐘（電爐功率不要調(diào)太大，以免管蓋爆開）；

i. 將泡沫板用鑷子夾出，置大冰盒中冷卻10分鐘，掌上離心，再放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

注意：裂解液也可酌情選用單去污裂解液或細(xì)胞裂解液等。

3、懸浮細(xì)胞蛋白提取

1）所需器材：制冰機(jī)、標(biāo)記筆、兩套1.5ml EP管（最好高溫高壓處理）、兩個(gè)大冰盒、長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶、10ml離心管、手套、移液槍、吸頭（最好高溫高壓處理）、濾紙、保存于4℃冰箱的PBS（最好高溫高壓處理）、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一種蛋白酶抑制劑，劇毒）、離心機(jī)、燒杯、4×SDS凝膠上樣緩沖液、二硫蘇糖醇（DTT）、泡沫板。

2）操作步驟

a.制冰機(jī)制冰；

b.標(biāo)記筆將2套EP管做好標(biāo)記；

c.將兩個(gè)大冰盒裝上冰，標(biāo)記筆做好標(biāo)記的兩套EP管置于一個(gè)大冰盒上,帶上另一個(gè)大冰盒，取出長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶平放在大冰盒上；

d. 戴好手套，將培養(yǎng)瓶細(xì)胞懸液吸至10ml離心管，4℃、3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄上清，加1ml保存于4℃冰箱的PBS重懸細(xì)胞，再轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至1.5mlEP管中，4℃、3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄上清，濾紙盡可能吸干管口殘留液體；

e. 取出保存于4℃冰箱的三去污裂解液、保存于-20℃冰箱的PMSF, 往培養(yǎng)瓶中滴加三去污裂解液（一般為47－141ul/50ml培養(yǎng)瓶）、再加入PMSF（二者比例為94：6），移液槍吹打混勻，冰上靜置15-25分鐘，以上步驟均需在冰上操作；

f.離心機(jī)預(yù)冷，將靜置15-25分鐘后的EP管4 ℃、10000轉(zhuǎn)離心10分鐘；

g.將燒杯用自來(lái)水洗凈，倒入單蒸水，電爐上煮沸；

h.備好4×SDS凝膠上樣緩沖液（存放在常溫），取出保存于-20℃冰箱的DTT置于冰上，用移液槍將離心后的上清液定量吸至另一套EP管中（勿吸取下層沉淀物），按上清液：4×SDS：DTT=3：0.8:0.2滴加4×SDS及DTT，掌上離心，然后小心將EP管插入泡沫板，投入已煮沸的燒杯中煮6-8分鐘（電爐功率不要調(diào)太大，以免管蓋爆開）；

i. 將泡沫板用鑷子夾出，置大冰盒中冷卻10分鐘，掌上離心，再放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

注意：裂解液也可酌情選用單去污裂解液或細(xì)胞裂解液等。

二：電泳

1、制備分離膠、積層膠

1）所需器材：制冰機(jī)、制膠槽、Teflon梳子、小燒杯、手套、大冰盒、去離子水、30%聚BXXA溶液、1.5mol/L的Tris-cl（PH值8.8）、1.0mol/L的Tris-cl（PH值6.8）、10%SDS（十二烷基磺酸鈉）、10%AP（過(guò)硫酸銨）、TEMED（四甲基乙二胺）、移液槍、吸頭。

2）操作步驟

a.制冰機(jī)制冰；

b.將制膠槽雙層玻片裝進(jìn)制膠槽小夾子（雙層玻片左右方及下方要注意對(duì)齊），濾紙吸干雙層玻片中殘留液體，再將小夾子裝進(jìn)制膠槽大夾子，平放（制膠槽所放平面一定要水平）；

c.將大冰盒裝上冰，戴好手套，取出保存于4℃冰箱的30%聚BXXA溶液、1.5mol/L的Tris-Hcl(PH值8.8)、1.0mol/L的Tris-cl(PH值6.8)、TEMED、保存于-20℃冰箱的10%AP，備好存放于常溫的去離子水、10%SDS，根據(jù)所需配制的分離膠濃度及量，依次往小燒杯中加不同體積的去離子水、30%聚BXXA溶液、1.5mol/L的Tris-Hcl、10%SDS、10%AP、TEMED。加入TEMED后，立即用移液槍吸頭混勻小燒杯膠液，倒入制膠槽雙層玻璃中（留梳齒+1cm長(zhǎng)以備加積層膠），輕輕抖動(dòng)幾下制膠槽使液面平齊，再用去離子水（當(dāng)BXXA濃度<8%時(shí)也可采用0.1%的SDS，當(dāng)BXXA濃度>10%時(shí)也可采用異丁醇）封閉液面以免氧氣擴(kuò)散進(jìn)入凝膠抑制聚合反應(yīng)，靜置半小時(shí)；

c.待分離膠凝固后（分離膠與去離子水界面可看到一條分離線），根據(jù)所需制備積層膠的濃度和量，往小燒杯中依次加入不同體積的去離子水、30%聚BXXA溶液、1.0mol/L的Tris-cl(PH值6.8)、10%SDS、10%AP，然后先將分離膠上層的去離子水倒去，再用去離子水沖洗去除未聚合的凝膠，濾紙吸凈殘留液體。往小燒杯加入TEMED，立即用移液槍吸頭混勻小燒杯膠液，倒入制膠槽雙層玻璃中分離膠上方，小心插入梳子，注意不能留有汽泡（操作時(shí)先使梳孔下緣接觸液面，再左右兩邊平衡緩慢插入梳子），靜置半小時(shí)待積層膠凝固（凝固后梳齒邊緣可看到分離線）。

2、電泳

1）所需器材：電泳槽、手套、膠、電泳液（可回收利用，四次一換為好）、蛋白樣品、1×SDS凝膠加樣緩沖液、大冰盒、微量加樣器、電泳儀。

2）操作步驟

a.將電泳槽上槽、下槽分別用去離子水洗凈，甩干；

b.戴好手套，取下制膠槽小夾子，緩慢移去梳子（兩邊要平衡移出），如有必要，使用接于注射器的平頭皮下注射針頭把積層膠上加樣槽之間的齒弄直，再用去離子水沖洗以去除未聚合的BXXA，取下制膠槽雙層玻片小心放入電泳槽上槽（較矮玻片向電泳槽上槽內(nèi)側(cè)），再一起放入電泳槽下槽，往電泳槽上槽緩慢倒入1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（存放于常溫，可回收利用，但最多4次），直至上槽電泳液略高于下槽電泳液，如有必要，使用接上注射器的彎形皮下注射針頭把凝膠底部?jī)刹ＡО逯g的汽泡排出，將電泳槽移至4℃電泳儀跑箱內(nèi)；

c. 備好微量加樣器、1×SDS凝膠加樣緩沖液（存放于常溫），取出保存于-20℃冰箱的蛋白樣品，置于大冰盒上。將大冰盒移至電泳儀旁；

d.將微量加樣器在電泳槽下槽沖洗3次后，吸取不同蛋白樣本，吸取體積一般為10-25ul，可根據(jù)蛋白濃度調(diào)整；加樣時(shí)注射針頭要緩慢上移，不要給側(cè)壁太大張力；加不同樣本時(shí)每加樣完一個(gè)樣本應(yīng)在下槽中洗滌3次加樣注射器（第一次洗滌液打掉）再加樣另一樣本，最后在所有不用的加樣孔中點(diǎn)上等體積的1×SDS凝膠加樣緩沖液；

e.插上電泳儀蓋板（注意對(duì)好正負(fù)極），接通電源，100V恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑跑至底部（注意標(biāo)記）（總用時(shí)依分子量大小和膠濃度而異，約2小時(shí)左右）。

3、考馬斯亮藍(lán)染色（可選項(xiàng)）：

1、所需器材：兩個(gè)培養(yǎng)皿（一大一?。?、刮勺、考馬斯亮藍(lán)染色液（可回收利用）、脫色液（可回收利用）、膠、常溫?fù)u床或4℃搖床。

2、操作步驟：

1）將兩個(gè)培養(yǎng)皿（一大一?。⒐紊子萌ルx子水洗凈，往小培養(yǎng)皿加入考馬斯亮藍(lán)染色液（約1/3體積）、大培養(yǎng)皿蓋住；

2）取出電泳槽內(nèi)槽，取下制膠槽雙層玻璃，去離子水沖洗，小心用刮勺刮開雙層玻璃（刮勺放在中間，左右平緩向前用力），再用刮勺定量切去上端積層膠，下端上樣緩沖液指示劑，左右兩端多余泳道（比目的泳道多一泳道），小心用刮勺將膠放入盛有考馬斯亮藍(lán)染色液的小培養(yǎng)皿中，用大培養(yǎng)皿蓋住常溫?fù)u床4小時(shí)以上或4℃搖床8小時(shí)以上；

3）將考馬斯亮藍(lán)染色液回收，倒入脫色液，常溫?fù)u床脫色4小時(shí)以上或4℃過(guò)夜。

三：轉(zhuǎn)膜（半干轉(zhuǎn)移法）

1、所需器材：半干轉(zhuǎn)膜儀、六個(gè)培養(yǎng)皿（三大三?。?、手術(shù)剪、鑷子、刮勺、小試管、濾紙、轉(zhuǎn)移液、甲醇溶液、膠、直尺、手套、PVDF膜。

2、操作步驟

1）取出半干轉(zhuǎn)膜儀陽(yáng)極，平放操作臺(tái)上；

2）往兩個(gè)小培養(yǎng)皿加入轉(zhuǎn)移液（用大培養(yǎng)皿蓋?。?、另一個(gè)小培養(yǎng)皿加入甲醇溶液（用大培養(yǎng)皿蓋?。?；

3）取出電泳槽內(nèi)槽，取下制膠槽雙層玻璃，去離子水沖洗，小心用刮勺刮開雙層玻璃（刮勺放在中間，左右平緩向前用力），再用刮勺定量切去上端積層膠，下端上樣緩沖液，左右兩端多余泳道（比目的泳道多一泳道），右上角作一切口標(biāo)記，記錄膠的長(zhǎng)度與寬度，去離子水沖洗后小心用刮勺將膠放入盛有轉(zhuǎn)移液的一個(gè)小培養(yǎng)皿中（用大培養(yǎng)皿蓋?。?；

4）戴上手套，定量剪一張長(zhǎng)度和寬度均略大于膠的PVDF膜，用鑷子將膜放入盛有甲醇溶液的小培養(yǎng)皿中，蓋上大培養(yǎng)皿浸泡5分鐘；

5）取6張濾紙，放入盛有轉(zhuǎn)移液的另一個(gè)培養(yǎng)皿中浸濕，拿至半干轉(zhuǎn)移器陽(yáng)極上，小試管輕輕搟壓去汽泡，膜在盛有甲醇溶液的小培養(yǎng)皿浸泡5分鐘后，用鑷子小心將膜夾至濾紙上（注意膜的四邊要在濾紙內(nèi)），用刮勺小心將膠從培養(yǎng)皿中取出，放在膜上，精確對(duì)齊（注意膠的切口標(biāo)記和膠的四邊要在膜內(nèi)），加點(diǎn)轉(zhuǎn)移液潤(rùn)濕，再定量剪6張長(zhǎng)度和寬度均略小于膠的濾紙，放入盛有轉(zhuǎn)移液的培養(yǎng)皿中浸濕，拿至半干轉(zhuǎn)移器膠上，加點(diǎn)轉(zhuǎn)移液小試管輕輕搟壓去汽泡；

6）蓋上半干轉(zhuǎn)移器負(fù)極，檢查兩板之間是否有直接接觸（以免造成短路），接通電源，12－18V恒壓1小時(shí)（電流在60mA以上，80mA以下為好，具體根據(jù)不同目的蛋白分子量而定，如電流達(dá)不到要求，可調(diào)節(jié)電壓）或60－80mA恒流1小時(shí)（電壓在6V以上，30V以下，具體根據(jù)不同目的蛋白分子量而定，如電壓達(dá)不到要求，可調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度）。

注意：如果是硝酸纖維素濾膜，則用轉(zhuǎn)移液而不用甲醇浸泡，余相同。

四： 麗春紅染色

1、所需器材：一個(gè)培養(yǎng)皿、手術(shù)剪、鑷子、麗春紅染色液（可回收）、TBST、膜、常溫?fù)u床或4℃搖床。

2、操作步驟

1）將培養(yǎng)皿用去離子水洗凈；

2）打開半干轉(zhuǎn)膜儀，用鑷子夾開濾紙，取出膜，手術(shù)剪在膜的右上角作一剪口標(biāo)記（標(biāo)記貼膠面為正面，即右手邊遠(yuǎn)側(cè)），再將膜夾至培養(yǎng)皿中（正面向上），滴入麗春紅染色液，輕輕晃動(dòng)（時(shí)間不宜太長(zhǎng)）；

3）回收染色液，去離子水漂洗數(shù)次，如紅色無(wú)法*退去，加入TBST，常溫?fù)u床或4℃搖床平緩搖動(dòng)脫色。

五：封閉

1、所需器材：玻棒、量筒、玻璃瓶、電子分析天平、脫脂奶粉、一個(gè)培養(yǎng)皿、TBST、直尺、封口袋、移液槍、吸頭、PDVF膜（硝酸纖維素濾膜）、封口機(jī)、常溫?fù)u床或4℃搖床。

2、操作步驟

1）5％脫脂奶粉配制

a.將玻棒、量筒、玻璃瓶用去離子水洗凈；

b.根據(jù)所需配制總量（一般為50ml），稱取適量脫脂奶粉(一般為2.5g/50ml)，倒入玻璃瓶，加入約50ml TBST，玻棒攪拌溶解，即配制成5%脫脂奶粉(可在4℃冰箱保存3天)；

2）將培養(yǎng)皿用去離子水洗凈，鑷子將膜夾至培養(yǎng)皿中（正面朝上），平放在常溫?fù)u床上平緩搖動(dòng)2小時(shí)以上或者4℃搖床8小時(shí)以上，如果免疫探針的非特異結(jié)合背景仍然太高，可加入Tween-20至終濃度為0.02%，在大多數(shù)情況下，加入這種去污劑不至影響抗體與靶抗原的特異性結(jié)合。

六：孵抗體

1、所需器材：一個(gè)培養(yǎng)皿、手術(shù)剪、直尺、鑷子、5%脫脂奶粉、TBST、移液槍、吸頭、一抗、二抗、PDVF膜（硝酸纖維素濾膜）、封口機(jī)、常溫?fù)u床或4℃搖床。

2、操作步驟：

1）將培養(yǎng)皿用去離子水洗凈；

2）做一封口袋（與膜相比長(zhǎng)3cm，寬1.5cm），加入5%脫脂奶粉、TBST（加入總量根據(jù)抗體濃度調(diào)整，但5%脫脂奶粉：TBST一般等于1：4），再加入一抗（保存于4℃冰箱），抗體濃度可根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明結(jié)合具體情況調(diào)整，（如1：1000、1：2000等），混勻，最后用鑷子將膜夾至一抗封口袋內(nèi)，小心去除汽泡（緩慢傾斜驅(qū)除氣泡），封口，放入培養(yǎng)皿中（最好墊張電話卡），平放在常溫?fù)u床上平緩搖動(dòng)2小時(shí)以上或4℃搖床8小時(shí)以上（期間翻轉(zhuǎn)數(shù)次）；

3）將培養(yǎng)皿用去離子水洗凈，倒入TBST（約1/3體積），手術(shù)剪剪開一抗封口袋，用鑷子將膜夾至盛有TBST的培養(yǎng)皿中（正面向上），常溫?fù)u床平緩搖動(dòng)5分鐘，5分鐘后，倒去TBST，再倒入新的TBST（約1/3體積），常溫?fù)u床平緩搖動(dòng)5分鐘，如此反復(fù)進(jìn)行3次；

4）做一封口袋（與膜相比長(zhǎng)3.0cm，寬1.5cm），加入5%脫脂奶粉、TBST（加入總量根據(jù)抗體濃度調(diào)整，但5%脫脂奶粉：TBST一般等于1：4），再加入二抗（保存于4℃冰箱），抗體濃度可根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明結(jié)合具體情況調(diào)整，如1：2000、1：3000、1：5000等，混勻，最后用鑷子將膜夾至二抗封口袋，小心去除汽泡（緩慢傾斜驅(qū)除氣泡），封口，放入培養(yǎng)皿中（最好墊張電話卡），平放在常溫?fù)u床上平緩搖動(dòng)2小時(shí)以上或4℃搖床8小時(shí)以上（期間翻轉(zhuǎn)數(shù)次）；

5）將培養(yǎng)皿用去離子水洗凈，倒入TBST（約1/3體積），手術(shù)剪剪開二抗封口袋，鑷子將膜夾至培養(yǎng)皿中（正面向上），常溫?fù)u床平緩搖動(dòng)5分鐘，5分鐘后，倒去TBST液，倒入新的TBST（約1/3體積），常溫?fù)u床平緩搖動(dòng)5分鐘，如此反復(fù)進(jìn)行3次。

七：壓片（有條件的地方可以用化學(xué)發(fā)光成像儀顯示條帶）

1、所需器材：制冰機(jī)、兩個(gè)培養(yǎng)皿、大冰盒、熒光劑A、熒光劑B、0.5mlEP管、移液槍、吸頭、顯影劑、定影劑、手套、壓片夾、雙層塑料膜、鑷子、濾紙、  手術(shù)剪、膠片。

2、操作步驟

1）制冰機(jī)制冰；

2）兩個(gè)培養(yǎng)皿用去離子水洗凈；

3）將大冰盒裝上冰，取出熒光劑A、B和0.5mlEP管、移液槍、吸頭放置于冰盒上，將顯影劑、定影劑依序倒入兩個(gè)培養(yǎng)皿；

4）戴上手套，打開壓片夾，鋪上雙層塑料，分別滴幾滴等量A、B液至離心管中（具體量根據(jù)膜大小而定），用移液槍吸頭攪拌混勻；

5）用鑷子將膜夾起輕輕抖動(dòng)幾次去除殘留TBST，而后放置雙層塑料中（正面向上，正面即貼膠面，也即右手邊遠(yuǎn)側(cè)面），沿中線滴幾滴A、B液，輕輕晃動(dòng)以便A、B液鋪滿整張膜，濾紙吸去膜四邊溢出液體，蓋上上層塑料袋，手背輕輕搟壓抹平；

6）關(guān)燈，觀察熒光，手術(shù)剪剪好膠片，放置上層塑料膜上方進(jìn)行壓片，壓片時(shí)間視情況而定（熒光越強(qiáng)，壓片時(shí)間越短；熒光越弱，壓片時(shí)間越長(zhǎng)），短至1分鐘，長(zhǎng)至1小時(shí)，一般在3-5分鐘左右；

7）用鑷子取出膠片，放置顯影液中顯影，再放置定影液中定影，而后進(jìn)行流水沖洗，掃描等處理。

八： 注意事項(xiàng)

1、摸索某一特定蛋白的溶解條件時(shí)，可考慮用劇烈的裂解緩沖液如三去污裂解液來(lái)提取。

2、如果壓片清晰度不好，可嘗試：1）連續(xù)壓幾張膠片；2）減少蛋白上樣量；3）降低一抗?jié)舛龋ń惦s帶）；4）降低二抗?jié)舛龋ń当尘埃?/span>

附錄：

1、PBS的配制：

900ml去離子水溶解以下成分

1）Nacl 8g

2）Kcl 0.2g

3）Na₂HPO₄.12H₂O 3.5g

4）KH₂PO₄ 0.2g

調(diào)PH值至7.4（也可不調(diào)）

定容至1000ml.

2、三去污裂解液的配制：

1）50mmol/L Tris堿（PH值8.0）（0.6057g/100毫升）

2）150mmol/L Nacl（0.8766g/100ml）

3）0.02%疊氮鈉（0.02g/100ml）

4）0.1%SDS（十二烷基磺酸鈉）（0.1g/100ml）

5）1.0ug/ml Aprotinin（可無(wú)）

6）1%Nonidet（NP-40）（1ml/100ml）

7）0.5%去氧膽酸鈉（0.5g/100ml）

8）100ug/ml PMSF（苯甲基磺酸氟）（臨時(shí)加入）

注意事項(xiàng)：用80ml去離子水溶解0.6057g Tris堿，調(diào) PH值至8.0，再用該溶液溶解2—7項(xiàng)，定容至94ml，PMSF配成16.67mg/ml的貯存液及1.667mg/ml的工作液, 每94ul的裂解液加6ul PMSF工作液。

3、SDS加樣緩沖液的配制：

1×SDS凝膠加樣緩沖液的配制：

1）50mmol/L Tris堿（PH值6.8）（0.1212g/20ml）

2）2%SDS（電泳級(jí)）（十二烷基磺酸鈉）（0.4g/20ml）

3）0.1%溴酚蘭（0.02g/20ml）

4）10%甘油（2ml/20ml）

注意事項(xiàng)：用10ml去離子水溶解 0.1212g Tris堿（調(diào)PH值至6.8），再用該溶液溶解4、2、3，定容至20ml.

2×SDS凝膠加樣緩沖液的配制，終濃度為：

1）100mmol/L Tris堿（PH值6.8）（0.2424g/20ml）

2) 4%SDS（電泳級(jí)）（十二烷基磺酸鈉）（0.8g/20ml）

3）0.2%溴酚蘭（0.04g/20ml）

4）20%甘油（4ml/20ml）

5）200mmol/L DTT（二硫蘇糖醇）(臨用時(shí)加入)

注意事項(xiàng)：用6ml去離子水溶解0.2424g Tris堿（調(diào)PH值至6.8），再用該溶液溶解4、2、3，定容至16ml；DTT配成1mol/L的貯存液[lml（略少） 0.01mol/L乙酸鈉溶液（PH值5.2）（分子量136.08）溶解0.15424g DTT，最好過(guò)濾除菌]，臨用時(shí)按上清液：2×SDS：DTT=1：0.8：0.2的比例加入。

4×SDS凝膠加樣緩沖液的配制，終濃度為：

1）200mmol/L Tris堿（PH值6.8）（0.4848g/20ml）

2) 8%SDS（電泳級(jí)）（十二烷基磺酸鈉）（1.6g/20ml）

3）0.4%溴酚蘭（0.08g/20ml）

4）40%甘油（8ml/20ml）

5）400mmol/L DTT（二硫蘇糖醇）(臨用時(shí)加入)

注意事項(xiàng)：用2ml去離子水溶解0.4848g Tris堿（調(diào)PH值至6.8），再用該溶液溶解4、2、3，定容至16ml；DTT配成2mol/L的貯存液[lml（略少） 0.01mol/L乙酸鈉溶液（PH值5.2）溶解0.30848g DTT，最好過(guò)濾除菌]，臨用時(shí)按上清液：4×SDS：DTT=3：0.8：0.2的比例加入。

5×SDS凝膠加樣緩沖液的配制，終濃度為：

1）250mmol/L Tris堿（PH值6.8）（配成0.606g/20ml）

2) 10% SDS（電泳級(jí)）（十二烷基磺酸鈉）（2g/20ml）

3）0.5%溴酚蘭（0.1g/20ml）

4）50%甘油（10ml/20ml）

5）500mmol/L DTT（二硫蘇糖醇）(臨用時(shí)加入)

注意事項(xiàng)：用2ml去離子水溶解0.606g Tris堿（調(diào)PH值至6.8），再用該溶液溶解4、2、3，定容至16ml；DTT配成2.5mol/L的貯存液[lml （略少）0.01mol/L乙酸鈉溶液（PH值5.2）溶解0.3856g DTT，最好過(guò)濾除菌]，臨用時(shí)按上清液：5×SDS：DTT=4：0.8：0.2的比例加入。

4、30%聚BXXA溶液的配置：

1）BXXA29g

2）亞甲雙BXXA1g

3）去離子水定溶至100ml

5、1.5mol/L Tris-cl PH 8.8的配制：

1）Tris-cl base 18.165g（分子量為121.1）

2）去離子水定溶至90ml

3）調(diào)PH至8.8

4）去離子水定溶至100ml

6、1mol/L Tris-cl PH 6.8的配制：

1）Tris-cl base 12.11g（分子量為121.1）

2）去離子水定溶至90ml

3）調(diào)PH至6.8

4）去離子水定溶至100ml

7、AP（過(guò)硫酸銨）的配制：

0.1gAP+1ml去離子水

8、TEMED的配制：

無(wú)須特殊配制，直接吸取原液。

9、10%分離膠的配制（其余濃度見分子克?。?/span>

10、5%積層膠的配制（其余濃度見分子克?。?/span>

11、Tris-甘氨酸電泳緩沖液的配制：

5x貯存液：

1）1250mmol/L甘氨酸（電泳極）(94g/L)

2）125mmol/L Tris堿(15.1g/L)

3）0.5%SDS（十二烷基磺酸鈉）（5g/L）

4）去離子水定溶至1000ml

工作液：200ml5x貯存液+800ml去離子水

1）250mmol/L甘氨酸（電泳極）

2）25mmol/L Tris堿

3）0.1%SDS（十二烷基磺酸鈉）

12、轉(zhuǎn)移緩沖液的配制：

2x半干法貯存液：

1）384mmol/L甘氨酸（28.8g/L）

2）48mmol/L Tris-base（5.8g/L）

3）去離子水定溶至800ml

半干法工作液：400ml貯存液+200ml甲醇溶液+去離子水

1）192mmol/L甘氨酸（14.4g/L）

2）24mmol/L Tris-base（2.9g/L）

3）20%甲醇溶液（200ml/L）

2X濕轉(zhuǎn)法貯存液：

1）78mmol/L甘氨酸（5.8g/L）

2）96mmol/L Tris-base（11.6g/L）

3）0.074%SDS(電泳極)（十二烷基磺酸鈉）（0.74g/L）

4）去離子水定溶至800ml

濕轉(zhuǎn)法工作液：400ml貯存液+200ml甲醇溶液+去離子水

1）39mmol/L甘氨酸（2.9g/L）

2）48mmol/L Tris-base（5.8g/L）

3）0.037%SDS(電泳極)（十二烷基磺酸鈉）（0.37g/L）

4）20%甲醇溶液（200ml/L）

13、考馬斯亮蘭染色液的配制：

50ml甲醇+40ml去離子水+10ml冰醋酸（冰乙酸）+2.5g考馬斯亮蘭R250或45ml甲醇+45ml去離子水+10ml冰醋酸（冰乙酸）+2.5g考馬斯亮蘭R250

14、考馬斯亮蘭脫色液的配制：

50ml甲醇+40ml去離子水+10ml冰醋酸（冰乙酸）或

45ml甲醇+45ml去離子水+10ml冰醋酸（冰乙酸）

15、麗春紅染色液的配制：

5x貯存液：

1）麗春紅S 0.1g

2）三氯（錄）乙酸1.5g

3）磺基水楊酸1.5g

4）去離子水定溶至10ml

工作液：

2ml麗春紅染色5x貯存液加8ml去離子水。

16、TBST的配制：

1）Tris堿 4.84g

2）Nacl 16g

3）去離子水定溶至1900ml

4) PH值調(diào)至7.6(加濃鹽酸3.0ml左右)

5）1‰Tween-20 2ml

6）去離子水定溶至2000ml

17、5%脫脂奶粉的配制：

1）2.5g脫脂奶粉

2）TBST定溶至50ml

18、熒光劑（武漢博士德）的配置：

1）吸180ul去離子水至EP管中

2）吸10ul A液至EP管中

3）吸10ul B液至EP管中

19、顯影劑的配制：

1）250ml去離子水預(yù)熱至50℃

2）顯影粉（先加小包，攪拌溶解后再加大包，溫度下降至18℃以下時(shí)即可使用）

20、定影劑的配制：

1）250ml去離子水預(yù)熱至50℃

2）定影粉（攪拌溶解，溫度下降至18℃以下時(shí)即可使用）