在分子生物學(xué)中，未知基因全長(zhǎng)序列的獲取是研究新基因的重要步驟。當(dāng)我們不清楚目的基因的完整序列時(shí)，獲得未知序列的方法有反向PCR、mRNA差異顯示技術(shù)、基因組減法技術(shù)以及cDNA文庫(kù)篩選技術(shù)等等......

背景介紹

今天我們來一起了解一種可從低豐度轉(zhuǎn)錄本中獲得cDNA末端序列的方法—RACE技術(shù)。當(dāng)我們不清楚目的基因的完整序列，只知道其中的一段序列時(shí)，就可以通過RACE技術(shù)獲得mRNA兩端序列，再與已知序列拼接，從而得到完整mRNA序列。相比其他獲得mRNA全長(zhǎng)的技術(shù)，RACE具有簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)的優(yōu)勢(shì)，因而得到較多的運(yùn)用。

RACE是什么？

RACE全稱為rapid amplification of cDNA end，即cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)，就是已知部分cDNA序列，基于mRNA逆轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)獲得完整的cDNA的 3'或5'末端的分子生物學(xué)技術(shù)。

RACE可以應(yīng)用在哪些實(shí)驗(yàn)方向？

構(gòu)建cDNA文庫(kù)

lncRNA全長(zhǎng)克隆

獲得抗體可變區(qū)序列

miRNA靶基因序列驗(yàn)證

已知基因一段序列，克隆旁側(cè)序列

獲得病毒基因組

......

RACE技術(shù)類型及特點(diǎn)？

RACE技術(shù)有多種類型，根據(jù)各個(gè)RACE技術(shù)原理的不同，適合于不同的RNA，快來跟著小編一起來了解下吧~

經(jīng)典RACE

經(jīng)典RACE技術(shù)是在1988年由Frohman等[1]發(fā)明。經(jīng)典RACE技術(shù)包括5'RACE和3'RACE，分別克隆cDNA的5'端和3'端。

1. 3'RACE利用真核生物mRNA 3'端具有poly A結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，使用5'端帶有接頭序列的oligo dT與之結(jié)合進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA；

2. 再利用根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的上游引物和與接頭序列互補(bǔ)配對(duì)的下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到cDNA 3'末端擴(kuò)增產(chǎn)物。

1. 經(jīng)典RACE技術(shù)中的5'RACE是利用根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的下游引物GSP作為逆轉(zhuǎn)錄引物，合成一鏈cDNA；

2. 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在新合成的cDNA 3'末端加上poly A；

3. 帶有接頭序列的Oligo dT引物與一鏈cDNA 3'末端的poly A結(jié)合，合成二鏈cDNA；

4. 再以第二鏈cDNA為模板，利用GSP和接頭引物作為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到cDNA 5'末端擴(kuò)增產(chǎn)物；

得到的5'末端產(chǎn)物和3’末端產(chǎn)物可以通過克隆連接到適當(dāng)?shù)妮d體上，進(jìn)行測(cè)序獲得末端序列。將測(cè)序得到的cDNA末端序列，與已知的中間序列進(jìn)行拼接，就可獲得cDNA全長(zhǎng)序列。

經(jīng)過科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，由經(jīng)典RACE又衍生出多種RACE技術(shù)，增加了RACE技術(shù)的適用廣泛性，我們?cè)賮硪黄鹆私庀缕渌腞ACE技術(shù)吧！

Cap-switching RACE

Cap-switching RACE針對(duì)mRNA發(fā)生斷裂的可能，進(jìn)行了技術(shù)優(yōu)化[2-4]。

1. Cap-switching RACE是以O(shè)ligo dT作為逆轉(zhuǎn)錄引物，逆轉(zhuǎn)錄獲得一鏈cDNA；

2. 當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄到mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)時(shí)，莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（MMLV）會(huì)在新合成的cDNA的3'末端加上若干個(gè)胞嘧啶；

3. 接著，使用5'端帶有接頭、3'端帶有poly G結(jié)構(gòu)的接頭引物與cDNA 3'端的poly C互補(bǔ)配對(duì)，逆轉(zhuǎn)錄酶繼續(xù)以接頭為模板合成cDNA，完成接頭轉(zhuǎn)化，新合成的一鏈cDNA 3'端就含有一段接頭序列；

4. 然后再利用接頭引物進(jìn)行PCR獲得RACE產(chǎn)物。

RLM-RACE

RLM-RACE技術(shù)的出現(xiàn)同樣也是為了擴(kuò)增到完整mRNA的5'末端，避免mRNA斷裂帶來的影響。

1. 首先在RNA體系中加入牛小腸堿性磷酸酶（CAP），特異性地識(shí)別并切除斷裂mRNA 5'端暴露的磷酸基團(tuán)；

2. 再向體系中加入煙草酸焦磷酸酶（TAP），切除mRNA 5'端完整的帽子結(jié)構(gòu)，使mRNA 5'端暴露出一個(gè)磷酸基團(tuán)；

3. 接著加入RNA連接酶將接頭與mRNA 5'端暴露的磷酸基團(tuán)連接，而切除了磷酸基團(tuán)的斷裂RNA則不能與接頭結(jié)合，這樣便獲得了5'端帶有接頭的完整mRNA；

4. 最后再進(jìn)行RT-PCR。